生物化学与分子生物学技术实践

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1、【本讲教育信息】一、教学内容选修1 生物化学与分子生物学技术实践 【重点导学】蛋白质的分离与纯化   从生物材料中提取某些特定成分  分子生物学进展与PCR技术 【全面突破】知识点1 蛋白质的分离与纯化1、蛋白质的分离2、蛋白质的纯化方法①透析法蛋白质分子不能通过半透膜（肠衣、玻璃纸、动物膀胱膜等）的特性，可将待纯化的蛋白质溶液装入半透膜制成的透析袋内，再将透析袋放入透析液（缓冲液）中进行透析。②离心沉淀法控制离心速率，使得分子大小、密度不同的蛋白质发生沉降分层，从而达到分离出不同蛋白质的目的。③凝胶色谱法又叫分配色谱法。是根据相对分子质量的大小分离蛋

2、白质的有效方法。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体。这些小球体大多数是由多糖类化合物（葡聚糖或琼脂等）构成的。④电泳法：带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。支持物电泳是目前纯化蛋白质的一种较为普遍的方法。支持物可以是滤纸、可以是醋酸纤维薄膜、大分子凝胶等。采用醋酸纤维薄膜作为支持物具有方法简单、快速、分离清晰、灵敏度高、样品用量少、没有吸附、点样后区带界限清晰等优点，广泛应用于科学实验、临床化验和生化产品的分析（血清蛋白、血红蛋白、糖蛋白等的分离与鉴定）等方面。醋酸纤维薄膜点样的操作流程：几点说明：1）膜的预处理：必须于电泳

3、前将膜片浸泡于缓冲液中，浸透后，取出膜片并用滤纸吸去多余的缓冲液，不可吸得过干。2）加样：样品用量依样品浓度、本身性质、染色方法及检测方法等因素决定。对血清蛋白质的常规电泳分析，每厘米加样线不超过2～3μL，相当于60～80μg的蛋白质。3）电泳：可在室温下进行。电压为25V／cm，电流为0.4～0.8mA／cm。4）染色：一般蛋白质染色常使用氨基黑和丽春红，血浆蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸-Schiff试剂，脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色。5）脱色与透明：对水溶性染料应用最普遍的脱色剂是5％醋酸水溶液。为了长期保存或进行光吸收扫描测定，可浸入冰醋酸：无水

4、乙醇=3：7的透明液中。 【典型例题】例1、回答有关蛋白质分离和纯化的问题（1）要获得血清蛋白的粗制品，必须将含有柠檬酸钠的血液进行              处理，然后将                装入透析袋中除去                    。（2）要获得血红蛋白，应如何破碎红细胞？            。（3）下图为血清蛋白通过醋酸纤维薄膜的电泳图谱，你认为含量最多的蛋白质是              ，含负电荷最多的球蛋白是            ，相对分子质量最大的球蛋白是                。（4）电泳是目前应用

5、最为普遍的          蛋白质的方法。解析：本题考查蛋白质分离和纯化的基础知识。答案：（1）离心   上清液   小分子物质   （2）加蒸馏水使其胀破  （3）清蛋白 -球蛋白  γ-球蛋白  （4）（分离）纯化 知识点2  从植物材料中提取某些特定成分芳香油挥发性强、易溶于有机溶剂。因此可以采用蒸馏法，萃取法、压榨法等进行提取。1、蒸馏法：植物芳香油提取的常用方法。蒸馏法的类型水中蒸馏水上蒸馏水汽蒸馏特点原料放在蒸馏容器的水中，水要完全浸没原料容器中水的上方有筛板，水量以沸腾时不浸润原料为宜蒸馏容器下方有一个通气孔。连接外源蒸汽，上方有筛板，

6、上面放有原料玫瑰精油的提取流程：2、萃取法植物芳香油可以溶于有机溶剂（石油醚、酒精、乙醚、戊烷等）中，对于不适于蒸馏的原料可以采用萃取法。大致方法是将干燥的植物粉碎，用有机溶剂浸泡后，芳香油就会溶解在溶剂中，然后蒸发掉有机溶剂就可以获得植物芳香油了。胡萝卜素的提取操作流程注意事项：使用较高沸点的水不溶性有机溶剂作为萃取剂；在加热瓶口安装冷凝回流装置，防止有机溶剂加热挥发；有机溶剂要能从产品中完全除去，不会影响产品质量。3、压榨法对于有效成分，在用水汽蒸馏法时会发生部分水解，用水中蒸馏法会产生焦糊的植物材料，可以考虑用旋转滤膜蒸馏法或压榨法。压榨法提取橘

7、皮油的操作流程：回顾与总结：五种物质的提取方法、原理与步骤提取物质提取方法提取原理步骤DNA盐析法①在不同浓度的氯化钠溶液中溶解度不同；②不溶于酒精，但某些蛋白质则溶于酒精①溶解在2mol/L的NaCl溶液中②加水稀释至0.14mol/L的NaCl溶液使DNA析出、过滤③加入冷酒精析出血红蛋白凝胶色谱法①根据相对分子质量大小①样品处理②粗提取电泳法②各种分子带电性质差异③纯化④纯度鉴定玫瑰精油水蒸气蒸馏法利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来①水蒸气蒸馏②分离油层③除水过滤橘皮精油压榨法、旋转滤膜蒸馏法通过机械加压、压榨出果皮中的芳香油①石灰水浸泡

8、、漂洗②压榨、过滤、静置③再次过滤胡萝卜素萃取法使提取物溶解在有机溶剂中，蒸发后得到浓缩物①粉