生物化学与分子生物学技术.ppt

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1、生物化学与分子生物学技术概论生物技术的定义利用生物(动物、植物或微生物)或其产物来生产对人类生命科学有用的物质或生物。●传统生物技术：酿造配育新种以生物化学或分子生物学的操作方法，来改变生物或其分子(遗传)形质，以达预期目的。●現代生物技术：细胞培养EnzDNACellAbHybridoma融合瘤定点突变生物信息学蛋白组学Abzyme催化性抗体反义基因DNA/RNA基因转移ModernBiotechnology酶学工艺诊断试剂抗体治疗基因治疗细胞融合组织培养干細胞动物克隆基因工程生物芯片人类基因组计划P

2、CR聚合酶链放应电泳层析离心分光光度基因操作其它分（离目的基因）切（割目的基因和载体）接（连目的基因和载体）转（化宿主细胞）筛（选阳性克隆）表（达目的基因）基本模式“纵向”体系“横向”体系1理论部分基因工程原理生化技术原理新技术讲座2实验部分分子生物学实验生化技术实验3录像部分实验原理实验技术基因工程原理基因重组：不同的DNA分子间发生共价连接形成重组DNA分子。重组DNA质粒DNA基因片段EcoRIBoyer和Cohen的实验Boyer和Cohen的实验pSC101pR6-5大肠杆菌pSC101抗四环

3、素pR6-5抗卡那霉素DNA连接酶重组DNA分子EcoRI抗卡那霉素基因培养平皿卡那霉素基因四环素卡那霉素基因大肠杆菌四环素平板抗四环素抗卡那霉素抗四环素抗卡那霉素人体生长激素释放激素(SS)抑制和调节多种激素的作用从动物脑中提取:5mg---50万只羊脑基因工程9升大肠杆菌培养液目的基因基因载体重组体分切接转筛表总体技术路线目的基因及载体的分离需要克隆的DNA片段：化学合成法cDNA文库基因组DNA文库聚合酶链式反应1目的基因的获取1）化学合成法：较短的核酸片段（60-80bp）用途：PCR引物测

4、序引物定点突变核酸杂交探针2）基因文库限制性内切酶……克隆、转化、培养、鉴定基因组DNA基因文库结构基因外显子内含子转录、加工修饰mRNA基因组DNA文库限制性内切酶基因组DNA基因重组转化细菌体外包装cDNA文库的组建：基因重组反转录酶mRNAcDNA基因文库的筛选：DNA探针：核酸杂交抗体：蛋白免疫杂交蛋白活性鉴定裂解变性显影引物引物*引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。*引物设计的主要原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。3’5’5’5’3）PC

5、R技术基因组PCR原理图3’3’3’变性、退火延伸变性、退火、延伸3’2载体DNA的选择功能：为目的基因提供进入受体细胞的转移能力。为目的基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力。为目的基因提供在受体细胞中扩增和表达能力。目的基因整合在宿主细胞染色体DNA中独立于宿主细胞染色体DNA外（独立的复制子功能）基因载体理想载体的基本条件：可转移性合适的复制位点多克隆位点：广泛、特异选择标志，便于筛选和鉴定分子较小，可容纳较大的外源DNA质粒噬菌体腺病毒载体逆转录病毒载体……种类：存在于细菌染色体外的小型环状D

6、NA分子。具有自我复制功能。带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物。经改造后具有多克隆位点。举例：pBR322质粒质粒宿主细胞ori抗Amp宿主细菌含Amp培养基多种酶切口多克隆位点限制性内切酶单一酶切口多克隆位点ori复制起始点遗传标记Amppolylinker基因载体选择标记ori多克隆位点转录终止区RBSPO表达型质粒载体图噬菌体载体50kb+LARALARAEcoRⅠEcoRⅠlacZcIAmNeoPBamHⅠHindⅢoriBamHⅠHindⅢ限制性内切酶酶切酶切限制性内切核酸酶在特异位点上

7、切割DNA分子分三类，常用为Ⅱ类酶识别序列呈回文对称命名：酶来源的生物名称缩写属名-种名-株名-发现次序5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’5’-GTTAAC-3’3’-CAATTG-5’EcoRⅠ的识别序列HaeⅠ的识别序列5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’5’NNNNNG3’NNNNNCTTAApEcoRⅠ的识别序列和酶切切口（粘端）pAATTCNNNNNN3'GNNNNNN5’5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘3

8、’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘5’NNNNNGTTpAACNNNNN3’3‘NNNNNCAApTTGNNNNN5’HaeⅠ的识别序列和酶切切口（平端）酶切条件：酶切缓冲液低盐组：0～50mmol/LNaCl中盐组：50～100mmol/LNaCl高盐组：100～150mmol/LNaCl磷酸二酯键的形成DNA连接酶DNA连接酶DNA连接酶目的基因与载体的连接T4-DNA连接酶：T4-噬菌体连接温度：不高于粘性末端熔点温度（Tm）≤