菌种保藏和使用技术

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1、菌种保藏和使用技术浙江省食品药品检验所王知坚菌种保藏和使用的有关概念菌种保藏和使用的有关法规我所现有菌种保藏管理规程基层单位可以使用的菌种保藏使用技术有关菌种问题的答复2概念标准菌株：由国内或国际菌种保藏机构保藏的，遗传学特性得到确认和保证并可追溯的菌株。标准储备菌株：由标准菌株经一次传代得到的培养物。商业派生菌株：由供应商提供的所有特性与标准菌株等效的菌株。代：将活的微生物接种到新鲜培养基中进行培养，并希望获取新的微生物培养物。这种操作方式，新培养物对接种培养物而言就称为一代。工作菌株：由标准储备菌株经传代得到的培养物。3中国医学菌种保藏中心提供的标准菌株4美国国家菌种保藏中心提供的标准

2、菌株5法国生物梅里埃公司提供的商业派生菌株（Bioball)6我所现在保藏的标准储备菌株7我所以往保藏的标准储备菌株8我所制备的工作菌株9法规中国药典2005年版中国药典2010年版实验室认可准则其他行业标准10中国药典2005年版无菌检查法：灵敏度检查项下菌种培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。微生物限度检查法：细菌、霉菌及酵母菌计数项下菌种同无菌检查法11中国药典2010年版在方法的附录中对菌种的规定同2005年版在新增的“药品微生物实验室规范指导原则”中对菌种有了较为明确的规

3、定允许使用标准菌株和商业派生菌株标准菌株应按保藏机构提供的说明进行复活标准储备菌株应进行纯度和特性确认标准储备菌株建议采用低温冷冻干燥、液氮贮存或超低温冷冻保藏的方法标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株冷冻菌株解冻后不得重新冷冻和再次使用工作菌株不可替代标准菌株，商业派生菌株仅可用作工作菌株12实验室认可准则检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明（CNAS-CL09）实验室必须保存有满足试验需要的标准菌种或参照标本标准菌种或标本必须从认可的菌种或标本收集途径获得。实验室必须建立和保存其所有菌种、标本的收集、贮藏、保存、确认试验的记录实验室应有文件化的程序管理参

4、照菌种（从原始菌种到日常工作用菌）。该程序应包括：参照菌种必须定期转种传代，并做确认试验，包括实验室中所需要的关键诊断指标，实验室必须加以记录并予以保存13每一支参照菌种都应以适当的标签、标记或其它标识方式来表示其名称、标准号、接种日期和所传代数其管理记录中还应包括（但不限于）以下内容：从原始菌种传代到工作用菌种的代数；菌种生长的培养基及孵育条件；菌种生存条件。14其他行业标准实验室质量控制规范食品微生物检测（GB/T27405-2008）实验室应制订并实施特定程序管理和使用标准培养物实验室应通过标准培养物来验收培养基、验证方法和评估实验操作实验室可使用来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标

5、准菌株，或使用与标准菌株所有特性等效的商业派生菌株标准菌株传代培养一次，制得标准储备菌株，同时应进行确认试验。建议使用深度冰冻或冻干的方法制备标准储备菌株。标准储备菌株经继代培养获得工作菌株。一旦标准储备菌株被解冻，最好不要重新冷冻和再次使用。工作菌株不可替代标准菌株。标准菌株的商业派生菌株仅可用作工作菌株。标准菌株发生变化经验证不符合规定应及时销毁。15我所的菌种管理规程菌种的采购菌种的复苏菌种的传代菌种的保藏菌种的使用和销毁16菌种的采购每年年底，由实验室菌种管理人员提出下一年度菌种采购的计划，计划购置的菌种一般为药典收载的标准菌种，填写请购单，经批准后，由所采购部门向指定的菌种保藏机

6、构购置。所购菌种均为冷冻干燥菌种。采购部门购入菌种后，应及时移交实验室。实验室菌种管理人员应仔细核对菌种发放单和冷冻干燥菌种管标签等各项信息，确认无误后，置4～6℃暂存。17菌种的复苏菌种在打开前应仔细核对标签上菌名、菌号。并注意一株菌种使用一套打开用具，严防交叉污染。菌种复苏应在生物安全柜内操作。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门菌、生孢梭菌和白色念珠菌可同时接种液体培养基和琼脂培养基斜面，枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、藤黄微球菌和黑曲霉可接种琼脂培养基斜面。取琼脂培养基斜面上的菌苔按要求对菌种的纯度进行鉴定。18菌种的传代应在生物安全柜中进行菌种的传代。取经过纯度鉴定的第1代

7、菌种管（琼脂培养基斜面培养物）用于传代制备第2代菌种。接种完毕，液体培养基或琼脂培养基斜面应在规定的温度下培养适宜的时间，芽孢杆菌宜培养5～6天，黑曲霉宜培养5～7天，其他菌种一般培养18～24小时。19菌种的保藏保存的容器为无菌冻存管，保藏温度为-70℃。在冷冻前，应贴上菌种标签。标签内容应包括菌名、菌号、传代日期和有效期。所有冻存管应立即置低温冰箱中，迅速冷冻。该方法保藏菌种的有效期规定为6个月。20菌种的使用和销毁