高速逆流色谱溶剂体系筛选及其联用技术

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1、高速逆流色谱溶剂体系筛选及其联用技术晋晓峰研发部副主管上海同田生物技术有限公司报告内容一、溶剂体系筛选方法二、高速逆流色谱联用三、关于上海同田生物一、溶剂体系筛选方法HSCCC分离条件分离效果溶剂条件转速流速温度样品基本原则:不造成样品分解或变性对样品有较大溶解度固定相在分离柱中有较好保留样品在两相溶剂系统中有合适的分配系数溶剂体系的筛选方法1.分配系数（K）法K＝Cs/CmCs为溶质在固定相中的质量浓度Cm为溶质在流动相中的质量浓度Cs和Cm的比值可通过HPLC测得理想的分配比值k=0.5~2，允许0.2~5CsCm两种溶质分离因子：α＝K1/K2（>1.5）当Cs/Cm＜＜0.5

2、时，出峰时间太快，分离度较差当Cs/Cm＞＞2时，出峰时间太长，且峰形变宽芦荟提取物的HPLC图谱实例（HPLC法测K值）芦荟未知物芦荟苷A芦荟苷B－上层－下层体系氯仿/异丁醇/甲醇/水（4/0.25/3/2）目标物质芦荟未知物芦荟苷A芦荟苷B分配系数K0.91.92.3HSCCC保留时间2.3h4.0h5.3h芦荟未知物芦荟苷A芦荟苷B芦荟提取物的HSCCC图谱芦荟苷B芦荟苷A芦荟未知物对已知化合物类别的物质可参考相关文献，在文献提供的体系的基础上进行调整对未知样品，可采用氯仿-甲醇-水=10-3-7或正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水=1-1-1-1两个极性分布范围较广的体系先进行尝试，

3、也可以根据样品的极性选择相对应的溶剂体系，再根据目标组分的分配系数进行调整2.经验法溶剂体系根据极性可以分为三类：疏水性（石油醚体系，正已烷体系）中等疏水性（氯仿体系，甲基叔丁基醚体系）亲水性（正丁醇体系，乙酸乙酯体系）3.分析型HSCCC法优点：分析时间短溶剂消耗少进样量小，节省样品确定的体系可直接用于放大制备，重现性佳仪器：TBE-20A转速：1600r/min流速：0.5ml/min样品：8％沙棘提取物体系：正己烷/乙酸乙酯/乙醇/水洗脱方式：下相作为流动相实例（分析型HSCCC法）1：1：1.2：0.81：1.2：1.2：0.80.8：1.2：1.2：1.20.8：1.2：

4、1.2：1.5正己烷/乙酸乙酯/乙醇/水（0.8：1.2：1.2：1.7）槲皮素山萘酚异鼠李素HSCCC工艺重现性TBE-20A分析型HSCCCTBE-300B半制备型HSCCCTBE-1000A制备型HSCCC4.多元溶剂体系的选择方法Ito方法HBAW方法ARIZONA方法Ito认为溶剂体系的筛选可以从氯仿-甲醇-水(2:1:1)开始，如果分配系数落在0.2-5的范围内，通过调整可以获得满意的分配系数。如果样品主要分布在非水相的下相中时，应尝试下表中箭头向上的体系，如果样品主要分布在上相时，则应试验相反方向的体系。BHAW方法是将非极性溶剂体系正已烷-乙腈（1:1）和极性溶剂体系

5、正丁醇-水（1:1）结合起来，形成了7种多元溶剂体系，编号为-3～+3首先试验0号溶剂体系，以确定下一步试验的方向。如果样品倾向于极性的水相，应该进一步实验0～+3号正方向的体系，否则应该试验0～-3号反方向的体系这组溶剂的特点是紫外透明性很好ARIZONA方法是结合乙酸乙酯-水体系（1：1，体系A，极性）和正庚烷-甲醇体系（1：1，体系Z，非极性）定义了23种整个溶剂范围内的溶剂体系，并用A～Z的23个字母（E，I，O除外）表示操作时只需做两个实验，将样品分别溶解在体系A和体系Z中，如果绝大部分样品集中在体系A的乙酸乙酯相和体系Z的甲醇相，那就有可能在体系A～Z中找到一个合适的体系

6、小结：溶剂体系的选择是HSCCC分离中最关键也是难度最大的一个环节，一般从样品的溶解度，通过参考文献及常用体系,测定K值等来筛选溶剂体系，然后再通过上述提到的各种方法进行调整。随着逆流色谱技术的普及，越来越多的人致力于体系筛选的研究工作。二、高速逆流色谱联用技术TBE-300A+ÄKTAPrimeTBE-300A主机接口1.HSCCC与ÄKTA系列中压系统的联用注意事项：ÄKTA系列设备的出场设置的最高压力为1MPa，适合HSCCC的0～2MPa压力范围；如不是，需要设置最高压力为1～2MPaÄKTA系列的连接接头为M5型号，而HSCCC为M6型号接头，所以连接时需要使用转换接头2.

7、HSCCC与ELSD的联用技术优势：基于样品的浓度梯度洗脱时基线稳定，无溶剂峰可用于检测挥发性低于溶剂的任何化合物HSCCC-ELSD联用技术已成功用于脂肪酸，生物碱，皂苷类，萜类，甾体类等的分离注意事项：ELSD连接接头为M5型号，而HSCCC为M6型号，所以连接时需要使用转换接头(厂家提供)半制备型和制备型HSCCC与ELSD检测器联用时，需用分流器实现同时检测与馏分的收集分流器解析图三通管HSCCC组分流出口调速阀组分收集分流－进入ELSD检测器分流