重组体的筛选第四章

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1、第四章重组体的筛选（RecombinantScreening)第一节重组DNA导入受体细胞一、外源DNA片段同载体分子的重组二、受体细胞三、重组DNA导入受体细胞的方法四、转化(transformation)第二节重组体的筛选一、遗传表型筛选法（Geneticphenotypeselection）二、电泳筛选法（Electrophoresisselection）三、分子杂交检测法（Molecularhybridizationselection）四、免疫化学检测法（Immunochemicalselection）五、亚克隆法（Subcloningselection）第一节重组DNA导入受体细

2、胞一、外源DNA片段同载体分子的重组1、外源DNA片段同载体分子的连接方法（1）平末端（2）粘性末端衔接体（linker)结合体（adaptor)同聚体加尾（homopolymer）二、受体细胞1、受体细胞(receptorcell)的概念2、受体细胞的选择原则1）便于重组DNA的导入2）能使重组DNA分子稳定存在于细胞中3）便于重组体的筛选选择与载体所含的选择性标记相匹配的受体细胞基因型4）遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长5）安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染6）选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞，利于外源基因蛋白表达产物在细胞内的积累。7）受体细胞在遗传密码

3、的应用上无明显的偏好性编码氨基酸的同义密码子之间的选择是有偏好的。植物的叶绿体和线粒体基因在同义密码子第三位上偏好使用A、U8)具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达9)在理论研究和生产实践上有较高的应用价值（一）原核生物细胞1、理想的受体细胞类型1）没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA的进入2）没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质3）基因组简单，不含线粒体和质体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析4）单细胞生物缺欠：1、不具备真核生物的蛋白质折叠系统2、缺乏真核生物的蛋白质加工系统3、内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白，造成表达产物不稳定。大肠杆菌、枯

4、草杆菌、蓝细菌枯草杆菌1)枯草杆菌具有胞外酶分泌—调节基因2）不产生内毒素3）具有芽孢形成能力（二）真菌细胞1）简单的真核生物2）蛋白质翻译后的修饰加工系统3）不含特异的病毒，不产生毒素4）培养简单5）外源基因表达产物分泌至培养基中（三）植物细胞全能性（四）动物细胞1）识别除去外源真核基因中的内含子2）翻译后能能被正确的加工与修饰3）易被重组DNA质粒转染4）产物分泌到培养基中三、重组DNA导入受体细胞的方法1)转化（transformation）2)转染（transfection）3)显微注射技术（microinjection）4)电转化法（electro-tranformation）,

5、也称为电穿孔（electroporation）5）基因枪法（genegun/particlegun），又称微弹轰击（micro-projectilebombardment）6）脂质体介导法（liposomemediatedgenetransfer）7）花粉管通道法质粒的不相容性(incompatibility)每个细菌细胞只能导入一个质粒DNA分子；每个菌落（一个单克隆）都是由一个细菌细胞形成的；每个克隆中所有的细胞都只含有同一种质粒2、受体细胞的感受态（1）感受态细胞（competentcell)的概念（2）感受态的机制局部原生质体化假说即局部失去了细胞壁结构或局部溶解细胞壁，使外源DN

6、A分子能通过质膜进入细胞。酶受体假说感受态细胞表面形成一种能接受DNA的酶切位点，使DNA分子能进入细胞。（3）转化的过程冰冷的50mmol/lCacl2溶液DNA分子在转化过程中将经历四个阶段第一个是吸附阶段，完整的双链DNA分子将吸附于感受态细胞的表面第二个为转入阶段，双链的DNA分子解链，以单链的形式进入细胞，而另一链则被降解；第三阶段是自身稳定阶段，外源质粒在细胞内又复制成双链环状DNA；第四阶段是表达阶段，即目的基因随同质粒的复制子一起复制，并被转录转译。（4）转化反应转化反应是使重组体DNA分子在热休克（heatshock）的短暂时间之内被导入受体细胞1）取制备好的感受态细胞1

7、00μl，置冰上5min融化。2）加入重组10μl，冰上放置30分钟。3）将管置42℃恒温水浴中热休克90秒钟，再置冰上10分钟。4）向管中加入LB液体培养基1ml，混匀后置37℃恒温臬中保温1小时。宿主细胞少数能发展感受态细胞万分之一的质粒分子能够进入感受态细胞极少数能够良好的增殖（5）转化率(transformationefficiency)（5）转化率(transformationefficiency)转化率是指D