酶联免疫吸附试验的影响因素

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1、酶联免疫吸附试验的影响因素检验科实验过程中的影响因素终止与读数结果的判读试剂加样温育样本洗板显色一、标本排泄物血清唾液尿液、粪便分泌物体液血清标本脂血标本溶血标本标本的保存标本的离心采血试管采血试管1.使用非抗凝标本（血清）；肝素抗凝血浆会增加OD值;EDTA、酶抑制剂(如NaN3)可抑制ELISA检测系统中辣根过氧化物酶活性;2.最好使用一次性玻璃试管或真空采血管.标本采集后，应先将标本37°放置30-60分钟后采用3000r/min离心15-20分钟，取上清液加样。15min3000r/min标本的离心标本的离心强行离心分

2、离血清，会使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块或附着在酶标板孔壁内使酶标记物不易洗掉，易造成假阳（阴）性结果。标本的保存1.一周----2～4℃保存；2.超过一周----建议-20℃保存。3.冰冻血清融解后，蛋白质会出现局部浓缩而分布不均，加样前应充分混匀。标本的保存4.混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。5.作多次检测，宜少量分装冰存;6.血清标本宜在新鲜时检测尽量避免细菌污染。避免细菌污染A.如有细菌污染，菌体中可能含有内源性的HRP会产生假阳性；B.细菌的生长，

3、其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用（如明胶酶等蛋白水解酶）；C.一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。溶血标本1.ELISA以辣根过氧化物酶标记抗原或抗体；2.红细胞破坏后可释放出大量的具有过氧化物酶活性的血红蛋白；3.残留的过氧化物酶催化底物产生非特性显色导致结果假阳性。脂血标本1.脂质小粒粘附在反应孔内壁；2.非离子型洗涤剂很难洗掉反应板上干扰性物质的非特异性吸附，引起吸光度A值升高，易造成假阳性结果。餐后抽血、高甘油三脂血症患者、标本离心时间、离心速

4、度不合适等，都可使分离的血清标本中残留着大量的脂质小粒。二、试剂1.试剂盒保存于2-8℃2.使用前应先将检测试剂盒放置室温平衡15-30分钟，保证酶等液体的初始反应温度及活性剂的溶解。3.观察外包装和内组份有无漏液。三、加样仔细注意加样全部过程移液器的使用及时放入孵育箱标本较多时，请分批操作试剂的滴加加样过程应注意：A.加样不可太快；B.要避免加在孔壁上部；C.不可溅出；D.避免产生气泡；E.尽可能使用同一加样器，装紧枪头，加样后充分混匀。试剂的滴加从滴瓶中滴加，应注意滴加的角度和速度。滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔之

5、间的现象，这样就会在孔内的非包被区出现非特异吸附，从而引起非特异显色。移液器的使用移液的方法及注意事项枪头的装配量程的调节量程的调节1.从大体积调为小体积2.从小体积调为大体积在该过程中，千万不要将按钮旋出量程，否则会卡住内部机械装置而损坏了移液枪枪头（吸液嘴）的装配使劲地在枪头盒子上敲几下——错误将移液枪（器）垂直插入枪头中，稍微用力左右微微转动即可使其紧密结合——正确枪头卡紧的标志是略为超过O型环，并可以看到连接部分形成清晰的密封圈。移液的方法前进移液法反向移液法一般用于转移高粘液体、生物活性液体、易起泡液体或极微量的液体

6、，其原理就是先吸入多于设置量程的液体，转移液体的时候不用吹出残余的液体。重复操作移液法适用于快速、简便地重复转移等量的同种液体。全血移液法移液的注意事项1.吸取液体时，移液器保持竖直状态，将枪头插入液面下1厘米。注意吸液体时，一定要缓慢平稳的松开拇指，绝不允许突然松开，以防将溶液吸入过快而冲入移液器内腐蚀柱塞而造成漏气。移液的注意事项2.设定加样体积，不能大于加样枪标定的移液范围3.加样吸嘴的洁净和装配4.吸取液体和排出液体动作都一定要慢。移液的注意事项5.加样枪严禁吸取有强挥发性、强腐蚀性的液体（如浓酸、浓碱、有机物等）6.

7、不要用大量程的加样枪移取小体积的液体，以免影响准确度。移液的注意事项7.如不使用，要把移液枪的量程调至最大值的刻度，使弹簧处于松弛状态以保护弹簧，并将其竖直挂在移液枪架上。8.表面清洁：用10%的次氯酸钠溶液或70%的酒精溶液清洁后，自然晾干。9.微量加样枪必须按要求定期进行校准。四、温育1.抗原抗体反应必须在一定的温度条件下反应一定的时间。2.温育所需时间与温度成反比。3.最为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。实际操作中应注意：温育温度的选择足够的反应时间“边缘效应”的排除温育温度的选择1.微孔板从室温拿

8、至水浴箱或温箱中时，孔内温度从室温升至37℃，需要一定的时间；2.在临床实验室中，通常是将微孔板一放入温箱即开始计时，这样就很容易造成实际测定中温育时间不够，弱阳性样本测不出来的问题。“边缘效应”的排除1.“边缘效应”，即外周孔显色较中心孔深;2.有研究证实在温育中的热力学梯