论影响酶联免疫吸附试验结果的常见因素及控制方法

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1、论影响酶联免疫吸附试验结果的常见因素及控制方法作者：贺智英　陈美霓　田红英　　[论文关键词]酶联免疫吸附试验；影响因素；控制方法　　论文摘要：酶联免疫吸附试验(enaymelikedimmunosorbentassay，ELISA)是20世纪70年代发展起来的一种检测技术，因其具有敏感性高、特异性强、操作简单等优点，被广泛应用于各种抗原和抗体的测定，为辅助临床诊断与生物科研起到了积极的推动作用。但ELISA测定中影响因素较多，操作过程中每个环节都会对试验结果产生影响，出现错误的结果。现笔者对影响实

2、验结果的常见因素及相应的控制方法分析探讨如下：　　1试剂的因素　　1.1试剂的选择　　试剂的选择是保证血液检测质量的关键要素。虽然国家采用批批检定的形式对ELISA试剂严格把关，但不同厂家的试剂在使用效果上仍存在在差异。要选购知名度相对高、具有“三证”的试剂，不要用无批号的试剂，最好选用与仪器配套的试剂。更不要使用过期的试剂和混用不同批号的试剂。　　1.2试剂的准备　　在临床实验室，对试剂的准备一般不太注意，通常的做法是在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用，而忽略了这种做法有可能影响后面时间不够的问题

3、，其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因此，在ELISA测定中试剂的准备最为关键的是，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20～30min后，再进行测定，使试剂盒在使用前与室温平衡，这样做的目的能使反应微孔内的温度较快地达到所需的温度，以满足后面的测定需求。　　2样本的因素　　2.1内源性干扰因素　　包括类风湿因子、补体、高浓度的非特异免疫球蛋白、异嗜性抗体、某些自身抗体等[1]。　　2.1.1类风湿因子在类风湿患者及正常人血清中，常含有较高或不同浓度的类风湿因子(RF)，其一般为I

4、gM型，亦有IgG和IgA型，具有与变性IgG产生非特异结合的特点，因为在ELISA测定中，其可与固相上包被的特异抗体IgG以及随后加入的酶标的特异抗体IgG结合，从而出现假阳性结果。避免其发生的方法有：①用F(ab)2替代完整的IgG。②标本用联有热变性IgG的固相吸附剂处理。③检测抗原时，可用2-巯基乙醇加入到标本稀释液中使RF降解。　　2.1.2补体在固相酶免疫测定中，来自哺乳动物的固相抗体和酶标二抗均有激活人补体系统的功能。一方面，固相抗体和酶标二抗可因其吸附及结合过程中抗体分子发生变构，

5、使Fc段的补体C1q结合点暴露出来，使C1q成为一个中介物将二者交联起来出现假阳性结果。另一方面，固相抗体也会因为活化补体的结合，封闭抗体和抗原的表位结合能力而引起假阴性。解决的办法是：①用EDTA稀释标本。②56℃30min加热血清使C1q灭活[1，2]。　　2.2外源性干扰因素　　包括标本溶血、标本被细菌污染、标本保存时间过长和标本凝固不全等。　　2.2.1标本的溶血血红蛋白中含铁血红素有类过氧化物酶的活性，因此，在以辣根过氧化物酶(HRP)为标志的ELISA测定中，如血清样本中血红蛋白浓度较

6、高，则很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色。所以在采血时应注意手法，采集的血液勿用力振荡，严防标本溶血。　　2.2.2标本的污染菌体可能含有内源性辣根过氧化物酶，可使实验出现非特异性显色。因此，ELISA检测宜采集新鲜标本，如不能当时测定，5d之内应4℃保存，1周后检测应低温冻存；同时，收集标本采用无菌试管，可防止标本的污染。　　2.2.3标本的保存标本在冰箱中保存过久，血清中IgG可聚合成多聚体，AFP可形成二聚体，在用间接法测定中会导致本底过深，甚至造成假阳性。冰冻

7、保存的标本反复冻融产生机械剪切力对标本中的蛋白等分子有破坏作用，可引起假阴性结果。因此，ELISA检测尽量采用新鲜标本，长时冻存的样本避免反复融冻[3]。　　2.2.4标本凝固不全凝固不全的血清中含有部分纤维蛋白原，可使结果呈假阳性。解决的方法有：①于采血管中加入适当的抗凝剂；②将采集后的血液放在架子上再放入37℃水浴中1h，待充分凝固后再离心分离血清[4]。　　3操作中的因素　　3.1加样　　孵育前加样时间过长，酶试剂加出孔外，使用滴瓶滴加试剂时，滴加的角度不同和挤压的力度不同，致使滴加的试剂量

8、不准，都可导致试验结果不准确。控制方法：①实验样本过多时，可分批次操作，以减少实验时间延长造成的误差；②加酶试剂后，用吸水纸吸干孔外试剂；③作定量试验时，使用加样器加注试剂，并经常校正其准确性，此外，要做到一份样本一个移液头，防止交叉污染。　　3.2温育　　温育是ELISA测定最为关键、最容易出现问题的步骤。最为常见的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。目前国内售ELISA试剂盒温育时间为37℃，30min~1h，进口ELISA试剂盒则通常为37℃，1～2h能有较完全的