分子生物学-技术2

《分子生物学-技术2》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、分子生物学大理学院生化学院阿周存第三节：聚合酶链反应（PCR）聚合酶链反应（polymerasechainreactionPCR）技术是KaryMullis发明的。它是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的新方法。在１９８５年的一次学术会议上，此方法首次被介绍，在分子生物科学家中也引起了链锁反应，大家很快地纷纷采用这个方法在短短的几年内，ＰＣＲ迅速成为分子生物学的一项常规手段，并得到了广泛的实际应用，被许多科学家视为近三十年来分子生物学领域最重要的一项技术突破。１９９３年，Mullis因此获得诺贝尔化学奖。PCR主要由高

2、温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成，通过变性，待扩增的靶DNA双链成为两条单链DNA模板；退火时,两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板.经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。一、PCR的原理

3、二、PCR反应系统的组成引物酶dNTP模板Mg2+TaqDNA聚合酶Buffer(缓冲液)（一）模板模板浓度过高会导致解链不完全，扩增效率下降，有时过高的浓度导致扩增不能启动；浓度过低，会影响产物的产率。一般在25-50ul的反应体系，模板量100ng-200ng左右。单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。若起始材料是RNA，须先通过逆转录得到第一条cDNA。（二）四种脱氧三磷酸核苷酸（4×dNTPs）dNTP终浓度高于50mmol/L会抑制Taq酶的活性，高浓度dNTPs易产生错误掺入，导致产物中的某些碱基发生改变

4、。而浓度太低，降低反应物的产量。一般浓度为200μmol/L。四种dNTP的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低合成速度，过早终止反应。（三）引物（primer)引物在PCR反应中非常关键，引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果（特异性和效率）。设计一对好的引物，PCR基本成功。引物的量对反应也有较大的影响，浓度过高易形成引物二聚体且产生，非特异性产物出现，低浓度引物经济、特异，但浓度过低，不足以完成30个循环的扩增反应，则会降低PCR的产率，常用量：25-50ul反应体系10-20pmo

5、l如何引物设计。三、TaqDNA聚合酶最适延伸温度70～75℃，在PCR反应混合液中，Taq酶在95℃的半寿期为40min，故在PCR循环中选用的变性温度，不宜高于95℃。普通的Taq酶没有3’→’5’外切酶活性，如果发生dNTP错误掺入，这种酶没有校正能力，因此运用Taq酶进行PCR，产物中可能出现点突变，对克隆不利。Taq酶延伸片段长度为10kb以内。现在利用高保真的VentTMDNA多聚酶可解决上述问题。该酶具有校正功能。在95℃的半寿期达23h。Taq酶的活力受Mg2+离子的影响,Mg2+过量易生成非特异性扩增产物，

6、Mg2+不足易使产量降低。最佳浓度为1.5mmol/L,也可以根据具体情况调节。五、PCR缓冲液维持反应体系中PH值的稳定。四．Mg2+三、PCR的特点1、高度的灵敏性:极微量的模板DNA即可扩增大量产物，pg级扩增到紫外线可见的ug级（106)。3、稳定可靠、重复性好，操作简便快速2、高度的特异性:19个bp的引物随机出现的频率419=2.75×1010bp/次；其次，反应退火温度较高，引物非特异性结合很低.2-3h可完成实验。4.对标本的纯度要求低：DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板。四、PCR的基本过程(一）引物的

7、设计与合成（二）构建反应体系（加样）（三）循环反应在循环反应开始前进行预变性：94℃4-5min1、变性：变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动,过高会影响酶活性。94℃30s（或95℃1-2min)2、复性：复性温度过高会影响引物与模板的结合，降低扩增效率，太高则不能扩增，复性温度可通过下列公式估计。时间一般为30s。Ta=Tm-5℃=4(G+C)+2(A+T)-5℃3、延伸：72℃时酶催化核苷酸的标准速率可达35～100个核苷酸/秒。延伸时间根据扩增片断

8、的长度而定1kb以上的DNA片段，可根据片段长度将延伸时间控制在1～7min。4、循环次数：一般为25～35个周期。次数太少扩增效率低，次数太多则易出现错误和非特异性背景。25个循环后一般可达到平台期（不再按指数增加）。94℃55℃72℃五、PCR中应注意的事项PCR反应中可能出现的问题：