分子生物学实验方法-2分子生物学

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1、6分子生物学研究方法（下）——基因功能研究技术蛋白质是生命活动的主要执行者蛋白质的功能主要通过与蛋白质以及其他生物分子的相互作用来实现6.1蛋白质相互作用技术研究举世瞩目的基因组计划使大量的新基因不断被发现，然而单纯的基因组DNA序列尚不能解答许多生命问题。基因是相对静态的，而基因编码的产物—蛋白质则是动态的，具有时空性和调节性，是生物功能的主要体现者和执行者。蛋白质的表达水平、存在方式以及相互作用等直接与生物功能相关。在所有生命活动中，蛋白质之间的相互作用是必不可少的，它是细胞进行一切代谢活动的基础。细胞接

2、受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控,介导细胞的许多生物学活性。生命的基本过程是不同功能蛋白质在时空上有序和协同作用新陈代谢以蛋白质复合体或多蛋白质网络协同作用实现细胞信号转导及病原体感染和免疫反应因此，揭示蛋白质之间的相互作用关系、建立相互作用关系的网络图，已成为蛋白质组学研究中的热点。研究蛋白质相互作用的方法也就具有更为重要的意义。免疫共沉淀荧光共振能量转移技术噬菌体展示技术酵母双杂交技术基因外抑制子合成致死筛选

3、分子生物学方法蛋白质亲和色谱法遗传学方法蛋白质相互作用研究方法生物物理学方法细菌双杂交技术蛋白质亲和色谱proteinaffinitychromatography基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上（如Sepharose离子交换琼脂糖），当细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的非目标蛋白则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或者洗脱条件而回收下来。洗脱（2）结合（3）检测（6）收集（5）洗脱（4）固定诱饵蛋白（1）融合蛋白pull-down实验为了更有效地利用

4、蛋白质亲和色谱，可以将待纯化的蛋白以融合蛋白形式表达，即将“诱饵”蛋白与一种易于纯化的配体蛋白相融合。1988年Smith等利用谷胱甘肽－S－转移酶（glutathione-S-transferase,GST）融合标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白。从此GST融合蛋白在蛋白质相互作用研究领域里得到极大的推广。GST融合蛋白在经过固定有GSH(glutathione)的色谱柱时，就可以通过GST与GSH的相互作用而被吸附。当再有细胞抽提物过柱，就可得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋白。一般来说GST融合蛋

5、白pull-down方法用于两个方面：一是鉴定与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用以上两种方法都有共同的缺点：假阳性。实验所检测到的相互作用可能是由蛋白质所带电荷引起的，并不是生理性的相互作用；蛋白的相互作用可能并不是直接的，可能是由第三者作为中介的；有时会检测到两种在细胞中不可能相遇却有极强亲和力的蛋白。实验结果还应经其他方法验证。以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。该法的优点是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可

6、以避免人为影响；可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物为直接相互作用的两种蛋白，另外灵敏度不如亲和色谱高。免疫共沉淀coimmunoprecipitation,CoIP在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团（供体）的发射光谱与另一个基团（受体）的吸收光谱有一定重叠，当这两个荧光发色基团在足够近（<100埃）时，就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即以前一种基团的激发波长激发时，可观察到后一个基团发射的荧光。荧光共振能量转移技术fluorescencer

7、esonanceenergytransfer,FRETBFP---GFPCFP---YFP激发波长发射波长B:blue383448G:green488510C:cyan434477Y:yellow513532荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生的构象变化，也能研究分子间的相互作用。它可以在活体中检测，非常灵敏，分辨率高，能够检测大分子的构象变化，能够定性定量的检测相互作用的强度。缺点此项技术要求发色基团的距离小于100埃。受荧光发色基团空间距离的限制,只能研究分子量小于200kD的蛋白，而且检测

8、的设备昂贵。噬菌体表面展示噬菌体表面展示技术是在深刻理解噬菌体遗传学和生理学特性的基础上产生的。其原理是将蛋白质文库整合到一个简单的噬菌体颗粒中，利用目的蛋白质与特异配基的亲和力，筛选和配基特异结合的蛋白质。噬菌体展示技术一般要经过多轮的筛选，这样就可以得到在文库中含量很低的与配基特异作用的蛋白质。丝状噬菌体蝌蚪形噬菌体λ噬菌体、T4噬菌体、T7噬菌体M13噬菌体最关键的优势：淘选的高效率使得在极低