重组单抗药物的肽图分析

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1、生物技术通报!研究报告!BIOTECHNOLOGYBULLETIN2008年增刊重组单抗药物的肽图分析魏敬双程立均刘进怀贾茜华北制药集团新药研究开发有限责任公司石家庄050015摘要"建立了重组单抗药物的肽图分析方法"在变性条件下向抗体溶液加入还原剂!打开抗体内部所有交联的二硫键!再加入烷基化试剂封闭所有的自由巯基!使抗体分子在溶液中以游离伸展肽链的形式存在"加入胰蛋白酶!将充分伸展的肽链酶解成小的肽段"用反相高效液相色谱层析分析肽图谱"对连续3批中试产品及理化测定对照品进行肽图分析!各样品均能酶解完全!批间肽图谱一致"该方法实用有效!适于进行重组单抗等结构复杂的大分子蛋白药物的肽

2、图检查分析"关键词"重组单抗肽图抗狂犬病毒单抗胰蛋白酶反相HPLCPeptidemappingofrecombinantmonoclonalAntibodyPharmaceuticalsWeiJingshuangChengLijunLiuJinhuaiJiaOianNewdrugR&dcenterNorthchinapharmaceuticalcorporationShijiazhuang050015AbstractAmethodwasestabiishedforpeptidemappingofrecombinantmonocionaiantibodypharmaceuticais

3、.Indenaturingconditionsreducingreagentwasaddedtorecombinantantibodysoiutionaiithecrossiinkeddisuifidebondswerebrokenandthenaikyiationreagentwasaddedtobiockthefreesuifhydryiresiduestheresuitantantibodymoiecuiesstayedinthesoiutionasdissociatedandextensiveiystretchedpeptidechains.Thetrypsinwasadd

4、edtothesoiutionandtheantibodywasdigestedtosmaiipeptidefragments.ReversedphaseHPLCwasusedtoseparateethepeptidefragments.Thein-housereferenceandthreeconsecutivebatchesofrecombinantantibodiesmanufacturedinpiiotscaiewereanaiysedaiithesampiescouidbedigestedcompieteiyandthepeptidemapprofiieswerecons

5、istantwitheachother.Themethodforpep-tidemappingwaseffectiveinproteinssuchasrecombinantantibodieswithcompiexstructure.KeywordsRecombinantmonocionaiantibodyPeptidemappingAnti-rabiesmonocionaiantibodyTrypsinReversedphaseHPLC1对于重组蛋白质药物的肽图检查我国药典biesmonocionaiantibodyrhRIG是采用基因工程手中收录了两种方法分别为胰蛋白酶裂解-反

6、相高段用CHO中国仓鼠卵巢工程细胞表达的全人源效液相色谱法和溴化氰裂解法其中第一种方法应IgG1亚型抗体用于狂犬病毒暴露后预防在产品用更为广泛但是对于重组单克隆抗体产品的肽研发过程中对重组抗体的肽图检查法进行了实验图检查如果使用药典中的胰酶裂解-反相HPLC摸索确定了使抗体产品酶解完全的实验方法分析方法几乎得不到裂解峰图1这是因为抗1材料与方法体分子结构复杂由四条肽链组成链间及链内由多1.1主要试剂与仪器对二硫键相联即使肽链被胰酶切开但仍被二硫Trypsin为Sigma公司产品NH4HCO3盐酸胍键联在一起无法分成独立的肽段碘乙酰胺DTT二硫苏糖醇均为分析纯试剂重组人源抗狂犬病毒单

7、抗recombinantanti-ra-基金项目十一五863计划生物和医药技术领域重大项目基金资助2006AA02A247万方数据作者简介魏敬双1967-女高级工程师从事生物技术药物研究开发工作2008年增刊魏敬双等:重组单抗药物的肽图分析173图1用现行药典方法得到的重组人源抗狂犬病毒单抗原液的肽图重组人源抗狂犬病毒单抗原液(批号1.2.4反相HPLC分析将终止反应的样品管20060501,20060701,20060801>及理化测定对照品10000r/min离心