S179C突变提高宇佐美曲霉木聚糖酶(XynII)热稳定性的研究

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1、S179C突变提高宇佐美曲霉木聚糖酶（XynII）热稳定性的研究孙军亭＊通讯作者第一作者：硕士研究生，李文静2，邬敏辰2*1(江南大学生物工程学院，江苏无锡，214122)2(江南大学医药学院，江苏无锡，214122)摘要宇佐美曲霉木聚糖酶（XynII）是G/11族高比活木聚糖酶的一种，通过S179C定点突变，发现酶最适反应温度由原来的50℃提高到52℃；50℃热处理，半衰期由原酶的23min延长到突变后酶的70min，热稳定性提高到原来的3倍；最适反应pH无变化。本研究提出了一种改造酶分子提高热稳定性的新思路。关键词木聚糖

2、；木聚糖酶；热稳定性；定点突变EnhancementofthethermostabilityofAspergillususamiifamily-11xylanasebyS179C-directedmutagenesisSunJunting1,LiWenjing2,WuMinchen2*1(SchoolofBiotechnology,JiangnanUniversity,Wuxi,214122,China)2(SchoolofMedicineandPharmaceutics,JiangnanUniversity,Wuxi,21

3、4122,China)AbstractXylanasefromAspergillususamiibelongstofamily-11anditisatypeofxylanasewhichhashighrelativeactivity.WiththemethodofS179C-directedmutagenesis,itsoptimumreactiontemperaturewasimprovedfrom50℃to52℃andafter70minofincubationat50℃itstillhad50%residualacti

4、vity,whiletheresidualactivityofthenativexylanasewas50%onlyafter23minatthesameincubationtemperature.Thethermostabilitywasenhanced3-fold.However,therewasnonotablechangesinoptimumpH.Keywordsxylan;xylanase;thermostability;site-directedmutagenesis木聚糖(xylan)是一类分子结构复杂的不均一

5、多糖，是植物半纤维素的重要组分，约占植物总糖的三分之一[1]，在自然界中是继纤维素之后含量第2丰富的可再生生物资源[2]。但木聚糖在许多工业中不能被直接利用甚至是有害的，只有将其降解为低聚木糖和木糖才能加以利用，变废为宝；如饲料中的木聚糖不能被单胃动物消化，反而增加了食物的粘度，阻碍其它营养物质（脂肪和蛋白质等）的吸收，故木聚糖又被称为"抗营养因子"[3]。木聚糖酶（xylanase）是指能专一降解半纤维素中木聚糖为低聚木糖和木糖的一组酶的总称；木聚糖酶在饲料、食品、造纸、纺织和能源等工业中显示出广阔的应用前景；其中一个重要

6、的用途是作为饲料添加剂应用于饲料工业，木聚糖酶能有效降解木聚糖，一方面使畜禽胃肠内食物粘度降低，有利于胃肠蠕动，促进畜禽的消化和吸收功能；另一方面酶水解产物低聚木糖和木糖能增加肠道内有益菌的数量，降低畜禽的腹泻率[4,5]。宇佐美曲霉（Aspergillususamii）木聚糖酶属酸性木聚糖酶，具有高比活性，最适pH4.2，最适反应温度50℃[6]；本实验室已从宇佐美曲霉中克隆出其木聚糖酶基因（xynII）[7]，并在大肠杆菌和毕赤酵母中得到表达[8]；国内杨浩盟等[9]在这方面做的比较好，他们基因改造后的木聚糖酶XynB在

7、毕赤酵母（GS115）中表达，250mL三角瓶摇床水平上最高酶活可达42IU/mL发酵液；而我们的木聚糖酶XynII以相同载体、宿主在同样的水平上表达，原酶最高酶活可达66IU/mL发酵液。但XynII热稳定性不是很好。本研究旨在利用蛋白质高级结构与一级结构关系的理论和知识，通过分子生物学的手段找到一株热稳定性更加突出的木聚糖酶。1材料与方法1.1材料菌种与质粒：木聚糖酶基因xynII（GenBank收录号为：DQ114485）由本实验从宇佐美曲霉（Aspergillususamii）中克隆出，并构建到pET-28a(+)-

8、xynII载体上；菌株大肠杆菌（E.coli）BL21-(DE3)-Codonplus，DH5α,载体pET-28a(+)；毕赤酵母GS115、载体pPIC9K均由本实验室保存。培养基：大肠杆菌培养基LB，毕赤酵母培养基YPD、MM、MD、BMGY和BMMY配方参见Invitrogen公司