脑星形细胞肿瘤中Survivin基因的表达及其病理意义

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1、脑星形细胞肿瘤中Survivin基因的表达及其病理意义研究生曹晓蕾导师陈莉脑星形细胞肿瘤是中枢神经系统中最为常见的一类肿瘤，约占颅内肿瘤的30%，可发生于各个年龄期，尤以30-40岁为高峰发病年龄[1]。由于脑星形细胞肿瘤无论分化高低均呈浸润性生长，因此多数病人远期疗效较差，即使经过标准治疗（手术+放疗+全身化疗）后，仍难以达到根治。一般认为其中位生存期不足1年[2],是一类严重危害人类健康的疾病。对肿瘤发生发展的机制研究中越来越多的证据显示细胞凋亡异常与细胞恶性增殖和分化受阻一样，在大多数恶性肿瘤的发病学上起重要作用，涉及到细胞凋亡信号途径的所有

2、方面。其中，研究最深入、广泛的是凋亡抑制基因和凋亡活化基因的异常。凋亡蛋白抑制因子家族（inhibitorofapoptosisproteins，IAPs）新成员Survivin可抑制多种凋亡刺激因子引起的凋亡，是迄今发现的最强的凋亡抑制因子。SurvivinmRNA在大多数正常组织中无表达[3],广泛表达于人类各种肿瘤组织。其独特的结构，选择性的细胞内分布的特点，具有明显细胞周期性，只在G2/M期表达，自1997年被发现以来，Survivin与肿瘤的关系已成为研究热点。肿瘤的生长、局部浸润及转移依赖血管形成，因此，肿瘤组织内的微血管形态、分布、数

3、量等对肿瘤的生长、治疗和预后至关重要。星形细胞肿瘤分化程度较低时，肿瘤常有出血、坏死。因而对星形细胞肿瘤中血管生成的研究更为重要。CD34作为一种公认的血管内皮标记物，可用于各种肿瘤间质中血管生成的研究，因此可通过CD34的单克隆抗体标记星形细胞肿瘤中的微血管（MV），在镜下（10×20倍）计算MVD,以探究星形细胞肿瘤中血管形成的规律。本实验将应用免疫组化和RT-PCR的方法检测70例脑星形细胞肿瘤中Survivin的表达，同时结合临床随访资料，探讨Survivin表达与脑星形细胞肿瘤的临床因素、肿瘤病理分级、MVD以及预后之间的关系。一、材料与

4、方法㈠标本人脑星形细胞肿瘤标本70例，分别由南通医学院病理教研室、南通医学院附属医院病理科、常州市第一人民医院病理科提供，为1996-2002年常规外检的病理蜡块。其中男48例，女22例，年龄20-77岁，平均年龄49.3岁。根据世界卫生组织的年龄分期标准以44岁为界，将本文病例分为青年组（≤44岁）和中老年组（＞44岁）两组。标本均经过常规病理组织学检查，双盲法根据瘤细胞多形性、核分裂、肿瘤中出血坏死、肿瘤血管形成等按照WHO标准进行分级：Ⅱ级10例，Ⅲ级26例，Ⅳ级34例。其中26例标本同时有新鲜肿瘤组织保存于－70℃低温冰箱（Ⅱ级3例，Ⅲ级7

5、例，Ⅳ级16例）。另取1例源于交通事故脑外伤手术患者的100mg脑新鲜组织、5例非正常死亡的人脑组织蜡块分别作为正常对照组，由南通医学院附属医院脑外科及南通医学院法医教研室提供。㈡主要试剂2.RT-PCR试剂RT-PCR试剂均购于上海生工生物工程技术服务有限公司，包括Trizol、RT试剂盒、PCR试剂盒、Survivin引物合成、β-actin引物合成。DL2000DNAMarker购于TaKaRa公司。1.免疫组化试剂兔抗人Survivin多克隆抗体（RAB-0536）、鼠抗人CD34单克隆抗体（MAB-0034）、超敏SP（鼠/兔）试剂盒（K

6、IT-9710）、DAB显色试剂盒（DAB-0031）均为即用型，购自福建迈新生物技术有限公司。㈢方法1.RT-PCR检测Survivin基因的表达⑴组织中总RNA的提取①取保存于-70℃冰箱中的人脑星形细胞肿瘤组织、正常人脑组织各约50-100mg（相当于1到2粒米粒大小），置于1.5ml玻璃匀浆器中，加入1mlTrizol充分匀浆。②将匀浆液转至1.5ml灭菌EP管中，室温静置5分钟。③加入0.2ml氯仿，震荡15秒，静置2分钟。④4℃离心，12000g×15分钟，取上清（100μl枪轻轻吸）。⑤加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静

7、置10分钟。⑥4℃离心，12000g×15分钟，弃上清。⑦加入1ml75%酒精，轻轻洗涤沉淀，4℃离心，7500g×5分钟，弃上清。⑧晾干，根据提取的RNA量加入适量的DEPC水溶解（65℃促溶15分钟）。⑨使用蛋白核酸定量仪定量：实际RNA浓度（mg/ml）=测得的RNA浓度×50/1000。⑩RNA变性胶电泳，电泳结束后将胶块置紫外灯下，观察条带，判断组织中的RNA是否降解。⑵cDNA第一链的合成（20ul体系）按以下次序将各成分加入一0.5mlEP管中5×RTbuffer4.0uldNTPMix（10mM）2.0ulOligo(dT)18Pr

8、imer(0.5ug/ul)1.0ul逆转录酶1.0ul酶抑制剂0.5ulDEPC水9.5ul模板链RNA2ul总体积20