细胞工程基本技术1

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1、第三章、细胞工程基本技术基本技术实验室条件无菌技术显微技术细胞观察与分析细胞分离细胞保存与复苏实验室基本组成细胞工程实验室它必须满足三个基本的需要，即：实验准备，包括培养基配制，洗涤与灭菌等；无菌操作；控制培养。基本实验室准备室：准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮，通风条件好。接种室：接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌。房间一般不宜过大，其规模根据实验需要而定。接种室除了出入口和通气口外，应行密闭。培养室：培养室的功能是对离体材料进行控制培养。其首要要求是要能控制光照和温度，

2、其次为防止微生物感染，培养室应保持干燥和清洁。辅助实验室细胞学实验室：其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。摄影室及暗室：其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下可建立此实验室。生化分析室：在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。实验室布局的基本要求便于隔离、便于操作、便于灭菌、便于观察。实验用品及主要设备玻璃器皿常用器械细胞培养的主要设备玻璃器皿液体储存瓶吸管离心管培养皿培养瓶与培养板其它器

3、皿1常用器械解剖刀、镊子、剪刀、洗耳球、封口膜、酒精灯等胞培养的主要设备基本设备：冰箱、天平、酸度计、、纯水器、电炉、培养基分装器、搅拌器。灭菌设备：蒸汽压力灭菌锅、烘箱、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。无菌操作设备：净化工作台、接种箱。光温控制设备：时间程序控制器、空调及温度感应器。细胞培养设备：培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、摇床、生物反应器等。细胞学鉴定设备：光学研究显微镜、倒置显微镜等。除上述基本设备外，如果有条件和需要还可配制摄影设备、生化分析设备等。无菌技术无菌技术是一个技术体系，涉及多方面因素、多个环节，只有

4、诸因素和环节都处理好，才能达到无菌。培养基器皿材料接种工具操作环境培养室工作台面具体的灭菌方法有多种污染检测与控制玻璃器皿清洗浸泡——刷洗——浸酸——冲洗无菌室无菌操作室和无菌培养室要求：墙壁光滑、地面平坦无缝，门窗密闭，无空气对流灭菌种类物理灭菌：高温高压灭菌、干热灭菌、射线辐照灭菌、过滤灭菌化学灭菌：熏蒸灭菌、消毒液灭菌（酒精、升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸钠、次氯酸钙、过氧化氢）抗生素消毒：在动物细胞培养中，常采用青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌素等抗生素抑制细菌、真菌等污染。根据灭菌对象选择不同的灭菌方法高温高压灭菌原理：在1

5、21℃高温和0.8kg/cm2-1.1kg/cm2的压力下，一般持续15-20分钟后，就可杀死一切微生物的营养体及其孢子。适用于器皿、工具、衣物和培养基灭菌。干热灭菌法将物品放入烘箱，利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固而达到灭菌的目的。适用于玻璃器皿。射线灭菌紫外光常用于培养室和接种箱或超净台的灭菌。操作前开灯20分钟可达到灭菌效果。过滤灭菌原理：将带菌的液体或气体通过孔径小于0.45uM微孔装置，使杂菌留在滤板上而液体或气体进入无菌空瓶中，从而达到除菌目的。常用于不能以高温高压灭菌的培养液、有机物质溶液和酶液的除菌。组织培养中常用的

6、过滤除菌器是滤膜过滤器，它清洗方便，过滤效果好。蒸灭菌用能杀死微生物的蒸汽进行灭菌，适用于无菌室的定期灭菌。常用的方法是将甲醛和高锰酸钾混合后，产生大量蒸气，以杀死微生物，效果较好。消毒液灭菌依化学灭菌剂的不同而适用于不同场合的灭菌。70%酒精几乎适用于组织培养中如各种器皿、培养材料、无菌室、接种箱、工作台、操作人员的手等；升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸钠、次氯酸钙、过氧化氢、抗菌素等适用于培养材料的灭菌。室内灭菌2%的新洁尔灭擦洗，70%乙醇喷雾，紫外灯照射约20分钟定期用甲醛和高锰酸钾熏蒸试剂和器皿的灭菌包括培养基、特殊药品和所有

7、无菌操作使用的器皿的灭菌培养基通常使用灭菌锅通过高压蒸汽灭菌进行灭菌污染检测与控制细菌：可采用抗生素预防真菌：可采用抗真菌剂防治支原体：可采用抗生素、加温处理（41℃）、使用支原体特异性血清病毒：脱毒细胞交叉污染：严格操作规程显微技术显微观察技术：显微操作技术：借助显微操作仪采用细微玻璃针或用微吸管、微电极、微热电偶等可进行细胞解剖、物质的抽取及注入、移植等操作。细胞观察与分析细胞计数与活力分析细胞固定与染色观察凋亡细胞观察染色体分析细胞计数与活力分析采用血细胞计数法计数活力分析：台盼蓝染色法：死细胞着色MTT：活细胞使其还原为兰色，

8、用酶标仪测定490nm处的光密度，计算细胞相对活力血球计数板计数法细胞固定与染色观察细胞固定甲醇-醋酸FAACarnoy细胞染色苏木精-伊红（H.E)染色法Giemsa染色法Feulgen染色法考马斯蓝染色法免疫荧光法免