第五章_体外分析技术

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1、1体外分析技术2定义以放射性核素或其他非放射性物质标记的配体(Ligand)为示踪剂，以配体和结合体的结合反应为基础，在试管内进行的微量生物活性物质的检测技术。3待测物质浓度与检测手段临床化学分析10-1210-910-610-310-0pg/mLng/mLmg/mLmg/mLg/L免疫分析TherapeuticDrugsThyroidHormoneFertilityHormoneAllergyCancerMarkersInfectiousDiseaseVitaminsSerumProteins常量微量超微量4体外分析技术是结合了放射性核素的高灵敏度和特异性结合反应的高特异性的一

2、种超微量分析技术，具有灵敏度高、特异性强、精密度好、应用面广、方法简便等优点。方法学基础结合反应遵守可逆反应的质量作用定律：k1,v1[R]+[L][RL]k2,v2定量手段放射性测量技术酶定量技术化学发光定量技术生物学基础特异性结合反应：抗原-抗体的免疫结合反应；配基-受体的结合反应；底物-催化酶之间的酶促反应；结合体对：抗原--抗体激素--激素结合球蛋白受体--配体8体外分析技术体外放射分析体外非放射分析放射性竞争结合分析放射性非竞争结合分析放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA)免疫放射分析酶免疫分析化学发光免疫分析荧光免疫分析(immunoradiomet

3、ricassay,IRMA)(EIA)(CLIA)(FIA)分类:第一节放射免疫分析法(Radioimmunoassay)Dr.Yalow在体外条件下,利用Ag与定量的*Ag对限量的特异性Ab的竞争结合反应，通过测定放射性复合物的量来计算出Ag量的一种超微量分析技术。10基本原理Ag-Ab+Ag*AgAbAg++*Ag-Ab+*Ag(B)(F)*Ag与Ag免疫活性相同*Ag＋Ag>AbAg=*Ag,AgAb=*AgAbAg>*Ag,*AgAb(B)*Ag(F)Ag<*Ag,*AgAb(B)*Ag(F)11Ag*AgAb*AgAbAgAb*Ag+++++++++++++++++++

4、++AgAg2550100200400800*AgAb分离B、FB%=B/(B+F)F%=F/(B+F)R=B/FB1%B2%B3%B4%B5%B6%123456浓度B%标准曲线Ag2550100200400800*AgAb分离B、FB1%B2%B3%B4%B5%B6%123456B%？60在实际的操作中，我们一般要设立以下几个反应管：1．最大结合管（Bo）：标准抗原的量为0，只有标记抗原和特异性抗体时，标记抗原与抗体充分反应后分离B和F，所测得的B的放射性为Bo。这是没有标准抗原与之竞争时，标记抗原和抗体的结合达最大值。2．非特异结合管（NSB）：标记抗原除了要和特异性抗体结合

5、以外，还要和一些杂质蛋白或容器的管壁等结合，对我们的分析结果产生影响。NSB管是用蒸馏水代替特异性抗体，在相同条件下反应后测得的放射性。3．总放射性管（T）：反应后不分离就直接测得的放射性就是总放射性。表示标记抗原抗体复合物和游离的标记抗原的总放射性。4．标准管（B1~Bn）：放有不同浓度的标准抗原，再加入相同量的标记抗原和特异抗体。一般在反应后分离出沉淀，测定沉淀的放射性作为B。5．样品管（Bx）：用同剂量的样品代替标准管中的标准抗原，在相同条件下反应和分离，同样取沉淀测得其放射性，就可以在绘制的标准曲线上找到样品的浓度。常用的有B%，B/F，B/Bo，F/B，Bo/B等这些反

6、应变量都可以用作纵坐标来对应标准抗原的浓度作标准曲线，选用的反应变量不同，标准曲线的形状也不同。但是这些标准曲线都是反映的反应变量对应标准抗原浓度变化而变化的函数关系。标准曲线左：横座标为等份刻度；　右：横座标为对数刻度操作基本步骤1.加样：加样总体积要保持一致，所处的介质环境也要一致。2.孵育：根据不同的分析对象孵育的温度和时间不同，一般是37℃。3.分离：选择好的分离方法分离游离抗原和抗原－抗体复合物。4.测量：测量游离或结合物部分的放射性。5.数据处理：绘制标准曲线和待测物浓度的计算。二、基本方法㈠基本试剂1.抗体2.标记抗原3.非标记标准抗原（标准品）2.标记抗原1）比

7、活度和放化纯度足够高比活度——每微克抗原上标记放射性核素的千贝可数（KBq/μg）放化纯度——具有免疫活性的标记抗原占总放射性的百分数。>90%2）半衰期足够长3）保持原有抗原的特性大分子：125I小分子：3Hor125I3.非标记抗原（标准品）化学结构、免疫活性与被测抗原相同高纯度二、基本方法㈡B和F的分离1、第一类2、第二类双抗体沉淀法PEG沉淀法固相第二抗体法+AgAb(1)Ab(2)Ab(2)Ab(1)Ag可溶性复合物可沉淀复合物试管试管分离方法的要求分离完全、快速。不影