逆转录PCR讲义

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1、逆转录—巢式PCR（nestedRT-PCR）一、实验目的：学习RT-PCR反应的基本原理。掌握血液等液体标本中提取RNA并逆转录的技术。了解其他标本（如组织块）中提取RNA的技术。二、实验原理RT-PCR是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经逆转录酶的作用以RNA为模板合成cDNA，再以cDNA为模板扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物

2、。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。巢式PCR是一种特殊的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物（外引物）扩增片段与普通PCR相似；第二对引物（内引物）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次继续在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR特异性非常高。三、主要仪器PCR扩增仪、高速冷冻离心机/台式高速离心机、Vortex震荡混匀器、水平电泳仪、凝胶成像系统、电

3、热恒温水浴锅四、主要试剂TRIzolReagentTM、AMV逆转录酶、RNA酶抑制剂、TaqDNA聚合酶（MgCl2）、dNTPMixture，10mmol/L、琼脂糖、溴化乙锭*、DNAMarker、三氯甲烷（氯仿）、异丙醇DEPC*（焦碳酸乙二酯）处理水：加100μlDEPC于100ml超纯水中，使DEPC的体积分数为0.1%，室温震荡至少4h；然后高压蒸汽灭菌20min。溶解RNA所需的DEPC水用无RNase的1.5ml微量离心管分装，-20℃保存；用于配置75%乙醇的DEPC水则直接置于4℃保存。75%乙醇溶液：取75ml无水乙醇

4、用DEPC处理水定容至100ml，4℃保存。所用容器及量筒均需洗净后200℃干烘8h。5×TBE：Tris碱54g，硼酸27.5g，0.5mol/LEDTA（pH8.0）20ml，加蒸馏水定容至1L，室温保存。0.5×TBE缓冲液：用蒸馏水将50×TBE缓冲液稀释10倍，于室温下保存。五、操作步骤病毒RNA的提取：1.将待测标本、阴阳性对照取出解冻；再取出2套RNase-free（无RNase）的1.5ml微量离心管和2支RNase-free的0.5ml微量离心管，并进行标记；2.取一套标记好的离心管，每管加入TRIzol500μl，再加入1

5、00μl血清/细胞培养液等液体标本和对照（阴性对照最先加，标本居中，阳性对照最后加；注意将枪尖伸至TRIzol中），用Vortex震荡混匀5sec（液体无明显分层），室温静置5min；3.每管加入氯仿100μl（注意沿着管壁加液，避免液体飞溅），用Vortex震荡混匀15sec（液体无明显分层），室温静置3min；4.4℃、12000rpm离心15min；待离心结束后，小心吸取上层水相至另一套标记好的RNase-free的1.5ml微量离心管，加入等体积异丙醇（根据吸取的量估算，可适当多加一些；注意沿着管壁加液，避免液体飞溅），颠倒混匀，室温

6、静置15-30min；同时，确认恒温水浴锅已打开；5.4℃、12000rpm离心10min；待离心结束后，直接倒去上清，每管加入75%乙醇500μl重悬沉淀（注意沿着管壁加液，避免液体飞溅），轻柔颠倒混匀5次；与此同时，取出特异性引物/寡核苷酸引物/随机引物、RNasin、5×RTBuffer、dNTPMixture解冻；6.4℃、8000rpm离心5min；待离心结束后，小心倒去上清；用瞬时离心机简短离心1-2s，仔细观察沉淀位置，沿管壁吸出底部残余液体；室温晾干5-10min（应防止过分干燥）；1.最后加入20μlDEPC处理水溶解RNA

7、沉淀，直接用于后续实验，或保存于-80℃备用。逆转录（RT）：在0.5mlRNase-free（无RNase）的微量离心管中依次加入：DEPC处理水9.0μl外循环下游引物（20pmol/μl）0.6μlRNA酶抑制剂（40U/μl）0.1μl总体积9.7μl再加入RNA溶液5μl，70℃水浴5min，再冰浴5min；再依次加入：5×AMV逆转录反应缓冲液4.0μldNTPMixture（10mol/L）1.0μlRNA酶抑制剂（40U/μl）0.1μlAMV逆转录酶（5U/μl）0.2μl总体积5.3μl42℃温育40min。巢式PCR（n

8、estedPCR）：第一轮PCR扩增体系为：10×PCR反应缓冲液2.0μlMgCl2（25mol/L）1.2μldNTPMixture（10mol/L）0.2μl