牡蛎疱疹病毒1型检测技术规范　巢式PCR法（定稿）

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1、ICS 11.220B41     DB37山东省地方标准DB37/TXXXXX—XXXX     牡蛎疱疹病毒І型检测技术规范　巢式PCR法Ostreidherpesvirus-1DetectionSpecification-NestedPCRXXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施山东省市场监督管理局   发布DB37/XXXXX—XXXX目  次前  言II1范围12规范性引用文件13术语和缩略语13.1术语和定义13.2缩略语14试剂及仪器14.1试剂24.2仪器25采样35.1采样对象35.2采样数量

2、、方法和保存运输35.3样品的采集36检测36.1DNA的提取36.2巢式PCR操作步骤36.3电泳及测序47结果47.1结果判定47.2结果表述4附　录　A（规范性附录）试剂及配制方法5附　录　B（资料性附录）检测目的片段的DNA序列及电泳图77DB37/XXXXX—XXXX前  言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由山东省农业农村厅提出并监督实施。本标准由山东省渔业标准化技术委员会(鲁TC03)归口。本标准起草单位：

3、山东农业大学、济宁滨阳生物科技股份有限公司、泰安益海生物科技有限公司、泰安智博生物科技有限公司、南京根洋生物科技有限公司、南京少伯生物科技有限公司、南京福海生物科技有限公司。本标准起草人：王雪鹏、丁雷、闫现广、王方鹏、郭志明、孙永灿、付天增、姜衡、黄金菁。7DB37/XXXXX—XXXX牡蛎疱疹病毒І型检测技术规范　巢式PCR法1　范围本标准规定了牡蛎疱疹病毒І型（Ostreidherpesvirus-1，OsHV-1）的巢式PCR检测方法，适用于对贝类样品进行疱疹病毒І型带毒情况的定性检测，以进行牡蛎疱疹病毒І型的流

4、行病学调查、诊断、检疫和监测。2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682　分析实验室用水规格和试验方法SC/T7205.1　牡蛎包纳米虫病诊断规程3　术语和缩略语3.1　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1.1　牡蛎疱疹病毒І型牡蛎疱疹病毒І型属于软体动物疱疹病毒科（Malacoherpesviridae）、牡蛎疱疹病毒属（Ostreavirus），是一种双链DN

5、A病毒，在世界范围内广泛流行，主要危害牡蛎、扇贝和魁蚶等多种双壳贝类，对贝类养殖业造成重大的损害。3.2　缩略语下列缩略语适用于本文件。bp：碱基对（basepair）dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）EB：溴化乙啶（ethidiumbromide）EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid）PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainrea

6、ction）Taq：水生栖热菌（thermusaquaticus）TE：Tris盐酸和EDTA缓冲液（EDTATris·HCl）Tris：三羟甲基氨基甲烷（trishydroxymethylaminomethane）4　试剂及仪器7DB37/XXXXX—XXXX1.1　试剂1.1.1　除非另有说明，实验用水均为GB/T6682规定的三级水或相当纯度的水。1.1.2　无水乙醇：分析纯。1.1.3　TE缓冲液按附录A.1的规定。1.1.4　抽提缓冲液按附录A.2的规定。1.1.5　蛋白酶K按附录A.3的规定。1.1.6　1

7、0mol/L乙酸铵按附录A.4的规定。1.1.7　Tirs饱和酚（pH≥7.8）：分析纯。1.1.8　4.1.8酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)：分析纯。1.1.9　4.1.9氯仿/异戊醇(24:1)：分析纯。1.1.10　50×TAE：见附录A.5，也可以直接购买市售产品。1.1.11　1×TAE：见附录A.5。1.1.12　70%乙醇按附录A.6的规定。1.1.13　dNTP（各2.5mmol/L）：生化试剂，含dATP、dTTP、dGTP、dCTP各2.5mmol/L的混合物，-20℃保存，用于PCR。1.1.

8、14　10×PCR反应缓冲液：见附录A.7，也可以直接购买市售产品。1.1.15　MgCl2(25mmol/L)：生化试剂，-20℃保存。1.1.16　TaqDNA聚合酶(5U/μL)：生化试剂，-20℃保存。1.1.17　外引物CF：5’-ATTACCCAGATTCCCCTC-3’，-20℃保存。1.1.18　外引物CR：5’-