何水林版基因工程第四章基因操作过程教学版

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1、第四章　基因操作过程转化子的筛选和鉴定（检）重组DNA分子的转化和扩增（转、增）DNA的体外重组（切、接）第一节DNA的体外重组DNA的体外重组：将目的DNA、载体DNA在DNA连接酶的作用下，在体外进行分子连接（重组）过程亚克隆：把DNA片段从某一类型的载体无性克隆繁殖支另一类型的载体的过程。理想的酶切位点应当符合下列几个条件位于载体上的酶切位点要尽可能少，最好是单一的酶切位点酶切位点前方要一个较强的启动子选择的载体必须在连接后对基因转录和翻译过程中的编码区读框不改变外源DNA与载体的连接方法黏性末端连接法平未端连接法人工接头连接法

2、同聚物加尾连接法1黏性末端连接法单酶切位点黏性末端连接法同种内切酶生产的粘性末端的连接同尾酶生产的粘性末端的连接单酶切位点黏性末端连接法的缺点自身环化双向插入多拷贝插入假阳性双酶切片段的定向克隆外源DNA和载体DNA经过两个限制性内切酶切割后为非同源互补的黏性末端连接外源DNA和载体DNA经过两个限制性内切酶切割后一侧产生的黏性末端，另一侧产生平未端（可先生成黏性末端再补平）双酶切片段的定向克隆的优点外源DNA只能以一个方向定向插入到重组质粒中，以便目的基因的正确转录和表达载体与外源DNA结合处的限制酶切位点仍然保留，可以随时从重组载

3、体中通过相应的限制性内切酶切割后分离获得目的基因不会自身环化，转化率高，转化后的细菌克隆大多数携带有目的基因的重组质粒不同粘性末端的连接2平末端的连接从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多提高平头末端连接效率的方法包括：加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200mM平末端的连接的优点适用于外源D

4、NA片段与载体只有一个匹配点，同时考虑靶基因插入方向时使用靶基因以一个方向插入且非重组克隆背景低可用T4－DNAligase连接任何平末端3人工接头连接法人工接头又称衔接物、适配子，是人工合成的具有一个或多个限制性内切酶识别和切割序列的双平端DNA短序列，其分子长度约为8－12bp。粘性末端的更换4同聚物加尾(homopolymertailsjoining)连接法同聚物加尾连接：利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3′端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工粘性末端，外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸dA(dG)和dT(d

5、C),然后在DNA连接酶的作用下,连接成为重组的DNA。这种方法可适用于任何来源的DNA片段。但方法较繁，需要λ核酸外切酶、S1核酶、末端转移酶等协同作用人工粘性末端的连接5′突出末端人工粘性末端的连接3′突出末端人工粘性末端的连接平头末端同聚物接尾法实际上是一种人工粘性末端连接法主要优点不易自身环化连接效率较高同一种DNA的两端的尾巴是相同的，所以不存在自身环化载体和外源片段的末端是互补的粘性末端是一种通用的体外重组的方法用任何一种方法制备的DNA都可以用这种方法进行连接5重组率重组率的定义重组率=含有外源DNA的重组分子数/载体分

6、子总数在常规实验条件下，重组率一般为25-75%重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。提高重组率的方法提高外源DNA片段与载体的分子比：5:1-10:1载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团：提高重组率的方法加装同聚尾末端：第二节　重组体导入重组DNA导入受体细胞的方法转化率转化细胞的扩增用于基因转移的受体菌或细胞1用于基因转移的受体菌或细胞各种基因工程受体的特性实验室常用的基因工程受体受体细胞应具备的条件1.1受体细胞应具备的条件限制性缺陷型外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，h

7、sdR-）重组整合缺陷型用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-）具有较高的转化效率具有与载体选择标记互补的表型感染寄生缺陷型防止重组细菌扩散污染，生物武器除外1.2各种基因工程受体的特性大肠杆菌遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌产结构复杂、种类繁多的内毒素枯草杆菌遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全，生长迅速，培养简单，不产内毒素适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌遗传欠稳定，载

8、体受体系统欠完备链霉菌抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素主要用于抗生素生产菌株的改良遗传不稳定，生长相对缓慢酵母菌具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定适用