核酸的分离方法

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1、第四章核酸的分离与纯化第一节基本概念一、核酸分离纯化的原则1保证核酸一级结构的完整性2去除其它生物大分子的污染（蛋白、糖类、脂类分子）。3去除其它核酸分子的污染（提取DNA，去除RNA污染）。4去除对酶有抑制作用的有机溶剂和高浓度金属离子。注意事项1简化操作步骤，缩短提取过程。2防止物理、化学因素（剪切力、高温、强酸强碱）对核酸的降解。3防止生物因素（核酸酶）对核酸的降解。二、主要步骤和基本方法破碎细胞→去除其它生物大分子→去除其它核酸分子→除盐、有机溶剂→进一步纯化核酸破碎细胞方法：超声、匀浆、液氮(剧烈)；蛋白酶K＋去污剂(温和)除蛋白质方法：酚、氯仿抽提(剪切力)；甲酰胺解聚

2、除其它核酸方法：选择性沉淀；酶解除盐方法：透析、凝胶过滤核酸质量检测：OD260/OD280(纯度)；琼脂糖电泳、脉冲场电泳(大小)第二节真核细胞染色体DNA的制备一、生物样品的制备1生物组织组织表面清理→液氮冷冻→粉碎组织块→DNA提取液（含胰酶）DNA提取液2培养的细胞细胞悬液→离心收集细胞→PBS洗细胞→DNA提取液悬浮细胞3血液样品新鲜血液→加ACD抗凝液混匀→0℃保存数天↖－70℃冻储→解冻后PBS洗细胞离心取下层白细胞→DNA提取液悬浮细胞二、染色体DNA的提取1酚抽提法悬浮于DNA提取液的细胞→蛋白酶K裂解细胞消化蛋白→酚抽提蛋白→离心→吸取上层粘稠水相→透析→获得2

3、00kbDNA↘NH4Ac沉淀→玻棒捞出DNA纤维(100-150kb)2甲酰胺解聚法酚抽提改为甲酰胺解聚，操作步骤少，所得DNA>200kb。3玻棒缠绕法用盐酸胍一步裂解细胞，简单快速。所得DNA约80kb,可用于Southernblot，不适于构建文库。4少量组织DNA提取法操作体积小，步骤相对简单。可用于果蝇、鼠尾、细胞等DNA的提取。DNA纯度低，分子量小，只适于Southern杂交。第三节质粒与噬菌体DNA的提取与纯化一、质粒的提取纯化1基本概念质粒是一种双链闭合环状DNA分子，它原本存在于细菌胞体内部，是细菌内的共生型遗传因子。随着细菌的扩增，质粒的拷贝数也增加。质粒是

4、携带外源DNA进入细菌扩增表达的媒介物。2质粒的制备(培养细菌，扩增质粒)挑单菌落→LB培养→摇菌过夜→生长对数期菌→加氯霉素进行选择性生长3质粒的提取（裂解细菌，去除蛋白和细菌染色体DNA）菌液离心收集菌体→STE漂洗菌体沉淀,去除代谢物→裂解细菌细菌裂解法：(1)煮沸法：溶菌酶消化细菌壁，煮沸使细菌染色体DNA、蛋白质变性。简单、经济。不适于富含糖类菌株(HB101、TG1)中质粒的提取，糖可抑制内切酶活性。不适于含有endA+型菌株中质粒的提取，这类菌含有核酸内切酶A，煮沸不能使其失活。煮沸时间过长，质粒DNA不可逆变性，内切酶切割困难，EB染色效率低。(2)去污剂法：SDS

5、解聚蛋白与DNA的结合。细菌悬浮液含10％蔗糖，提高溶液的渗透压，减轻细菌裂解时DNA泄漏过快产生的机械剪切力以及后续操作中的机械剪切力。提取效率低。但温和，适于>15kb的质粒的提取。(3)碱变性法：pH12～16时，线性细菌染色体DNA变性，闭环质粒不变性。中和后，在高盐存在下，DNA聚合成网状不溶物，在SDS作用下DNA与蛋白质形成沉淀，CC质粒DNA仍为可溶物。(4)小量一步提取法：将裂解细菌和蛋白质变性一步完成，操作简单、快速（0.5h可完成）、经济。所提质粒可用于酶切图谱分析。细菌培养物＋酚/氯仿→离心→上清为质粒DNA(5)菌落裂解法：不摇菌、不酶切。适于阳性克隆鉴定

6、。(6)魔力柱小量质粒DNA制备：碱裂解＋特殊树脂构成的柱层析免去离心、沉淀DNA的步骤，省时（15'可完成），质粒纯度高（可用于测序、体外转录实验）(7)质粒的大量制备：与小量制备原理相同，方法相似。注意：加氯霉素抑制菌体生长。两次接菌。4质粒DNA的纯化不仅去除蛋白质、糖类、染色体DNA、RNA等杂质，还要使质粒构型单一。(1)CsCl密度梯度超离心法：纯化的质粒纯度高，可用于转基因动物、真核细胞转染、DNA外切酶删切缺失等实验(2)聚乙二醇沉淀法：经济简单，尤其对碱裂解提取的质粒的DNA的纯化效果好。所提的质粒可用于细菌转化实验、酶切。二、噬菌体的提取1基本概念(1)噬菌体是

7、一种病毒，可破坏细菌并在其中繁殖。可用作扩增基因的载体。(2)噬菌体感染细菌→溶菌生长→形成透亮的噬菌斑(3)噬菌体的形成单位(pfu):每1个最初感染细菌的噬菌体代表1个噬菌体形成单位。(4)噬菌体的效价(pfu/ml):单位体积样品中所含活的噬菌体的数目。2噬菌体的制备（扩增过程）噬菌体感染细菌→形成噬菌斑107pfu→吸取噬菌斑，加入受体菌→振摇6～12小时→溶液先浑浊又变清亮（细菌生长，噬菌体溶菌）→氯仿抽提去除细菌碎片→取上清测效价108-109pfu→4℃