蛋白纯化常见问题(精华哦)

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1、蛋白纯化陈虹亮总结Sunday,November25,2007521.我现在手头有个融合蛋白，纯化的时候用助溶剂溶解后做了GST亲和层析，之后用蛋白酶切割后却发现目的蛋白没有活性。请问有哪些可能会出现这种原因？怎么解决？测过基因序列，没有问题。细胞破碎后，融合蛋白在沉淀里，我用助溶剂提取后，可以用GST做亲和层析，但效率只有50～60％左右。洗脱完融合蛋白不需要助溶剂，但这样的条件下切割完后目的蛋白会沉淀，我用0.5％CHAPS助溶可勉强溶解部分，目的蛋白疏水性比较强。 既然是疏水性很强你可以加点甘油或者乙二醇降低极性，这样溶解就会好得多，此外你也直

2、接加2%的PEG这样也降低极性，同时保护你的蛋白，你再做纯化就可以了，我以前遇到这样的蛋白是用10%的乙醇加3-5%的PEG5000，这样的情况下蛋白还是活性回收率很高，我觉得那些表面活性剂能不用还是不用的好，你失去活性你可以监测一下提取，纯化，酶切到底哪里失去了活性，这样更容易解决你的问题。还有注意缓冲液PH值，看看改变它对溶解度有没有影响。蛋白有沉淀那你可以稍微把蛋白的浓度降低点，这也是个办法。2)请问楼主有没有合成过配体为FMN的亲和胶？ 我已经给你发了相关一些偶联的材料，请查收，现在一般要自己合成亲和填料，有很多公司都提供活化好的介质，自己偶

3、联就可以，其中比较常用的有溴化氰琼脂糖凝胶，环氧琼脂糖凝胶，氨基琼脂糖凝胶，羧基琼脂糖凝胶，活化酯琼脂糖凝胶，以及巯基琼脂糖凝胶等，但是如果是小分子的配基最好选择有3-10碳作为手臂的活化介质为好，此外也曾经有文献报导固定辅酶时，偶联位置不同，选择性有差别，因此你可以选择自己适合的活化介质。不同的活化的介质对偶联的配基有不同的要求，所以要对自己的配基了解比较清楚就可以选择合适的活化介质。我一般在合成的时候大多选择环氧琼脂糖凝胶，它能应用的范围广氨基巯基羟基都可以，而且合成的介质刚性好，非特异吸附少，所以不需要特殊处理未反应基团。此外键合的键很稳定，配

4、基脱落少。我觉得是不错的选择。 包涵体的蛋白复性做得不多,但是我记得有个哥们说最管用的办法也是最简单的方法,他说在复性的时候尽量别想什么太高难的技术,那些时髦但不一定好用,常用的有透析复性,稀释复性,包括国外的专家也这么说.我觉得有时候开始摸不出来未必就是方法不行,关键要经常改变条件.层析复性很时髦,但是真正能用的不很多,我觉得蛋白这东西难就在于大多都不相同,所以关键要多看文献,多琢磨自己蛋白的特性,多尝试。 3)SephadexG-25（medium）柱脱盐时，盐浓度太高对柱效有影响吗？若有，一般对盐浓度限度如何？大家别客气，除盐对于浓度应该也是有

5、一定的限制的，同样的样品盐浓度高的自然要比浓度低的要在柱子上走的峰要宽些，相对需要的柱子的分辨率也要高点，但是在正常的范围如1-2M应该影响不大，不过要除得很干净还是尽量少上点样品，我觉得上样的体积毕竟比浓度的影响更大。 4)我的蛋白17kd左右，能跟肝素亲和，一般用离子交换和亲和层析纯化，现在我用聚乙二醇修饰它，分子量增加5000左右，修饰率不可能达到100％，请问修饰后能用什么纯化方法可以把修饰的和未经修饰的分开？（当然修饰后还残留有聚乙二醇，这个小分子也要除掉）他们大多用凝胶过滤，我觉得这也不错的做法，毕竟PEG是链状的分子，在柱子上和普通蛋白

6、行为不一样，修饰度越高那么出峰也越后，因此你的蛋白选择sephadex52G50试试，它的范围在1000-30000，应该是不错的选择。此外PEG是个疏水性的链，修饰后的蛋白疏水性增强，修饰度越高，疏水性越强，可以用这个原理分离。离子交换也可以选择，因为同样道理，修饰度越高，电荷被屏蔽也越多，电荷也越少，因此应该修饰度越高越先出。亲和也离子交换一样的道理，你可以试试，你手头的亲和能不能分开，你在这几个方法里选择看哪个更经济好用就可以。 5)我是个新手，谢谢楼主给我解决了许多难题。我有个问题困绕很久，从细菌中提取酶，好象用常规的方法（超声波破壁，缓冲液

7、提取），总是拿不到我要的蛋白。是不是这种蛋白也是疏岁水性较强，需要加助溶剂才能提取出来？另外，我是不是也可以加点甘油或者PEG来提取？其实这个问题我觉得是这样的，既然你是提取那肯定是有沉淀和上清，你的目标蛋白的分子量你是应该知道的，那么跑电泳先看它到底是在上清还是沉淀里，剩下的问题你再解决如何提取。对于不同的酶要看酶稳定如何，你可以用不同的PH去提取，我曾经提取一个酶用水就是提取不出来，需要用盐才能提取出来，多试试，设计个方案，这样才能解决问题，所以不一定加甘油就管用，你还得注意破碎本身会不会有问题，倒回去做做也许能找到真正的原因。有什么问题继续探讨

8、。 6)HPLC是用来分析检测or分离纯化？如果可以用来纯化，上样量那么小有什么意义呢？如果是用来分析检测，