常见蛋白纯化

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1、前言：近年来随着生物技术的进步，特别是基因工程的迅猛发展，表达蛋白已经变得很容易，相对而言，纯化却是一个非常繁杂的工作，所以越来越多的研究者把需要表达的目标蛋白和亲和纯化用的标签融合表达，这样纯化相对得比较容易，即使如此，由于蛋白的多样性，纯化依然是比较复杂而专业的工作，尤其对于不熟悉纯化的研究者而言，它成为一个项目的瓶颈，本手册就是把一些相关的材料汇集，希望对纯化重组蛋白有所帮助。1．1常见纯化的标签理想的标签需要有以下的几个特点，1最好能一步纯化得到纯品；2对目标蛋白的结构和活性没有影响；3方便切除标签；4应用范围广，可适用各种表达系统或目标蛋白。但是没有哪个标签是

2、完美的，只能根据实际需要去自己筛选，下表是部分的标签以及纯化的方案：标签纯化用的填料或配基洗脱方法多聚组氨酸（6XHis）螯合镍、铜、钴离子的填料咪唑或降低pH谷胱甘肽硫转酶（GST）键合谷胱甘肽的亲和填料10-20mM还原谷胱甘肽麦芽糖结合蛋白（MBP）淀粉琼脂糖凝胶麦芽糖金黄色葡萄球菌蛋白AIgG琼脂糖凝胶低pHFlagpeptide抗Flag抗体,M1,M2低pH或EDTA多聚精氨酸（Poly-Arg）SP琼脂糖凝胶高盐多聚半胱氨酸（Poly-Cys）活化巯基琼脂糖凝胶DTT多聚苯丙氨酸（Poly-Phe）苯基琼脂糖凝胶乙二醇钙调蛋白结合肽钙调蛋白EGTA纤维素结

3、合域纤维素盐酸胍或脲几丁质结合域几丁质巯基乙醇，半胱氨酸由于篇幅有限，手册只只写多聚组氨酸标签、GST融合蛋白。2．组氨酸标签蛋白的纯化His-Tag融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱去（IMAC）纯化。2．1IMAC(ImmobilizedMetal-ionaffinitychromatography)是Porathetal.1975年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白，198

4、7年Smithetal.发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadexG-25作用力更强，此前在1986年他和他的合作者用2+Ni-IDA-sephadexG-25亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。同年1987年2+Hochulietal.发现带有相连组氨酸的多肽和Ni-NTA填料作用力更强于普通的肽，1988年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC变得非常普遍，相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表达带六个组氨酸标签的蛋

5、白配合IMAC纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。3+1986年Porathetal.还发现Fe-IDA-sephadexG-25可以用于磷酸化蛋白的纯化，而后发现Ga3+-IDA也有同样的效果，这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和纯化，同时IMAC也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽，应用非常广泛。市面常见的商品化IMAC用于带六个组氨酸标签蛋白的配基有以下几种：螯合金属离子的配基螯合金属离子的价位和标签结合位点IDA33NTA42CM-Asp42TED51可选择的纯化填料：填料名称配基配基密度载量镍琼脂糖凝胶FFIDA约40

6、umol/ml平均10mg/ml，最大70mg/ml镍NTA琼脂糖凝胶FFNTA20umol/ml平均5-10mg/ml2.2影响IMAC纯化结果的因素：2.2.1填料的种类：不同填料厂家的填料有差别，所以使用过程最好能得到厂家的技术支持，因为不同的厂家填料不同，此外蛋白纯化个性很强，没有哪一个填料是能适合所有带六个组氨酸标签蛋白的纯化，载量高和特异性好本身就是矛盾。2.2.2填料的配基种类、密度、金属离子种类填料最简单的判断是螯合好同样的金属离子，哪家产品的颜色越深就意味着和蛋白的作用力越强，适用范围越广，载量也越高，纯化的好坏关键看纯化的条件，仅有填料的特异性是不够

7、的，同样配基密度下IDA填料的亲和力要比NTA的强，所以NTA上不能吸附的样品可以选择IDA为配基的填料。螯合金属离子和蛋白作用强弱为铜和镍离子的强，而锌和钴离子的弱。因此如果一个蛋白作用力强，想得到好的特异性可以选择螯合钴离子，它还有一个优点是不怕还原剂，特别时候有高浓度的还原剂。相同金属离子，IDA的强于NTA。螯合金属离子的价位越低和蛋白的作用力越强。同时镍离子是最常用的，如果有条件可以换不同金属离子以得到更好的效果，因为不同的金属离子有不同的选择性。因此要希望填料应用范围广就选择镍琼脂糖凝胶，如果是希望特异性好而且稳定就选择镍NT