《质粒的酶切》ppt课件

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1、质粒的酶切酶切片段的回收酶切片段的连接亚克隆流程示意关于限制性内切酶1.定义：识别双链DNA分子核苷酸序列并加以切开2.来源：细菌的限制修饰系统3.特性：识别4~6个核苷酸序列产生平端和粘端4.应用：定点切割酶切产生的末端（1）———GAT↓ATC——————CTA↑TAG———EcoRⅤ酶切产生平端———GATPATC——————CTAPTAG———（2）———G↓AATTC——————CTTAA↑G———EcoRⅠ酶切产生5’突出粘端———GPAATTC——————CTTAAPG———(3）———CTGCA↓G——————

2、G↑ACGTC———PstⅠ酶切产生3’突出粘端———CTGCAPG——————GPACGTC———限制性内切酶的定义、命名1.定义：广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II型限制酶。2.命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。例如：HindⅢ前三个字母来自于菌种名称H.influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。EcoRI—EscherichiacoliRIHindⅢ—HaemophilusinfluensaedⅢSacI(II)—Streptomycesachromag

3、enesI(Ⅱ)酶切反应限制性内切酶反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。20μl体积反应体系如下：A:质粒（pGEM-1808或pET21a）0.5μgB:10×酶切buffer2.0μlC:HindⅢ0.5μlD:EcoRⅠ0.5μlE:加ddH2O至20μl37℃水浴消化1小时。酶切示意图EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠpGEM-NGFNGFNGF酶切pGEM载体EcoRⅠEcoRⅠ质粒的酶切电泳琼脂糖冻融法回收、纯化DNA片段1.在紫外灯下仔细切下含所需DNA片段的胶条（小于0.6g）捣碎，置于1.5ml离心

4、管中。2.加入等体积的Tris-Cl饱和酚（pH7.6），振荡混匀；-20℃放置5-10min待结冻；3.10000rpm×5min，上层液转移置另一离心管中；4.原管加入1/4体积H2O于含胶的离心管中，振荡混匀；-20℃放置5-10min待结冻；5.10000rpm×5min，合并上清液；6.用等体积酚/氯仿抽提2次、氯仿抽提1次，取上清于新微量离心管；7.加入1/10体积3MNaAc（pH5.2），2.5倍体积预冷的无水乙醇，-20℃，放置30min（或过夜）；8.13000rpm×10min，弃上清；75%乙醇洗沉淀1

5、-2次，晾干；9.适量H2O或TE溶解；电泳检测。关于连接酶定义：ATP存在下，在3’OH和5’P之间形成磷酸二酯键。特性：连接粘端的效率远高于平端。策略：1.首选不匹配粘端2.次选匹配粘端，载体脱磷3.平端连接，提高酶量不匹配粘端连接图示匹配粘端连接图示平端连接图示DNA片段的连接反应连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行1.10μl体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1∶1-1∶5），补ddH2O至8μl。2.轻轻混匀，稍加离心，置56℃5

6、min，迅速转入冰浴。4.加入含ATP的10×Buffer1μl。5.T4DNA连接酶1μl。6.稍加离心,14-16℃连接8-14hr。T-A连接NGFNGFPCR产物AATTpGEM-TpGEM-NGF连接连接产物的蓝白斑鉴定