《质粒酶切`鉴定》ppt课件

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1、质粒酶切、鉴定及DNA片段的凝胶回收一.实验目的1.了解质粒酶切及电泳鉴定原理。2.掌握核酸片段的凝胶回收纯化操作技术。第一部分质粒的酶切及电泳鉴定一.实验原理限制性内切酶是一种工具酶，其特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸序列的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA双链，形成一定长度的DNA片段。如：EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列和切口是：EcoRⅠ：G↓AATTCHindⅢ：A↓AGCTT限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少酶切片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。用已知分子

2、量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，就可以粗略推测分子形状相同的未知DNA的分子量。_+酶切反应系统包括：DNA，酶，buffer，灭菌水注意：不同公司的酶和buffer系统是不同的，所以一个反应应该用同一个公司的酶和buffer。1，DNA：自己制备的DNA，样品中不应该有酚，氯仿，酒精，EDTA，盐离子等的污染，以免影响酶的活性。2，酶：酶量并不是越大越好，酶体积不应该超过总反应体积的1/10。(因为酶是储存在50%甘油中的，而反应体积中甘油的浓度超过5%就会使酶出现星号活性，即切割不应该切的位置)。3，buffer：不同的酶配有不同的buffer，产品目录和酶的使用说明中会说

3、明该酶用哪种buffer，有些buffer中需要另外添加BSA。4，反应体积，通常1到几微克DNA的反应体积可以控制在50到100微升，用20单位的酶来切。5，反应条件，大多数酶都是37度半小时以上。6，双酶切因为不同的酶需要不同的buffer，所以有两种情况：1)两种酶是同样的buffer。尽量用同一个公司的酶，这样就跟单酶切操作差不多，可以同时加入两种酶，注意事项是体积和酶量。2)两种酶是不同的buffer，先用一种buffer离子浓度底的酶切，电泳检测，单酶切开以后，将产物抽提，沉淀，加入离子浓度高的buffer再酶切。二.仪器和试剂1．主要仪器（1）1.5mL塑料离心管（2）微量加

4、样器10μL、100μL、1000μL各一支（3）台式高速离心机（12000r/min）（4）水浴锅、电泳仪、电泳槽2．材料重组质粒pMD19-b（插入外源基因大小约500bp）3．试剂（1）限制性内切酶BamHI、HindⅢ及缓冲液K；（2）1×TBE缓冲液：称取Tris10.88g、硼酸5.52g和EDTA0.72g，用蒸馏水溶解后，定容至200mL，用前稀释10倍。（3）EB染色液：终浓度为0.5μg/mL。三.操作步骤H2O5.5μl质粒DNA(100ng/μl)15μl10×酶切缓冲液(Kbuffer)2.5μlBamHⅠ(5U/μl)1μlHindⅢ1μl2.37℃水浴3

5、h-4h。3.将Eppendorf管置65℃水浴中10min，通过加热使酶失活以终止反应，或加入2ulloadingbuffer终止反应。混匀(12000rpm离心5sec)1.反应体系的建立:（25μl体系）4.DNA琼脂糖凝胶电泳检测质粒酶切电泳图质粒DNA酶切图操作注意事项：1.吸样量一定要准确;2.为了不使酶污染而导致浪费，最后才加酶;3.要求在冰上操作，并充分混匀;4.开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防污染;5.样品在37℃与65℃保温时，将离心管盖严，以防水进入管内造成实验失败。重组所用质粒载体（2.692kb）pMD19载体结构第二部分DNA的凝胶

6、回收传统的DNA回收的方法主要基于降低凝胶的熔点以释放DNA，然后酚/氯仿抽提，乙醇沉淀回收。现多用公司生产的商品化的试剂盒，其原理是采用凝胶裂解液（如含有降低熔点的NaI）融化凝胶释放DNA后，采用特殊的硅胶树脂吸附DNA后，用洗液洗去杂质，最后用洗脱液洗出DNA。本次实验采用北京博大泰克生物基因技术有限责任公司B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒回收。实验原理仪器和试剂1.仪器：电泳仪，水浴锅，离心机2.材料：酶切的DNA样品3.试剂：北京博大泰克生物基因技术有限责任公司生产的B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒Cat.NO.MK005按凝胶重量：溶胶液=1:3加入溶胶液60℃溶胶10mi

7、n-20min将溶胶液转移至吸附柱12,000rpm离心30s，弃废液加入500ul漂洗液12,000rpm离心2min,弃废液，重复3次12345加入20ul洗脱液，静置5min吸附柱移至新的1.5ml离心管12,000rpm离心5min弃洗脱柱，保存样品DNA酶切条带回收步骤回收电泳图约2690bp约600bpDNA片断的连接实验六二.实验原理(质粒酶切与鉴定)DNA片段之间的连接主要是在T4DNA连接酶的作用下，使