《血栓与止血检验》ppt课件

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1、第十三章血栓与止血检验编辑制作熊石龙一、基本理论血管壁的正常结构包括三层：内层、中层和外层内层：内皮细胞+基底膜内皮细胞管壁有肝素类物质内皮细胞内含细胞器（棒状小体vWF和t-PA，TM，AT-Ⅲ,PAI-1等）中层：平滑肌细胞（脉细血管无此层）外层：结缔组织血管壁的结构第十三章第一节血管壁的止血作用及检验激活血小板激活凝血过程抗血栓特性收缩反应血管壁的止血功能第十三章第一节血管壁的止血作用及检验一、基本理论血小板的止血功能第十三章第一节血管壁的止血作用及检验血管损伤（抗血栓特性降低）血管收缩激活凝血过程血流减慢纤维蛋白形成血管内皮下成分暴露

2、血小板黏附、聚集、释放血栓形成血浆血管性血友病因子抗原vWF:Ag，ELISA法原理纯化的兔抗人vWF:Ag抗体包被聚苯乙烯反应板，加入稀释的待测血浆，样本中的vWF:Ag结合于固相的抗体上，然后加入酶标记兔抗人vWF:Ag抗体，与其定量结合，洗去多余抗体后，加底物显色，通过查找标准曲线，即可计算出vWF:Ag的含量。第十三章第一节血管壁的止血作用及检验二、血管壁（内皮）检验vWF:Ag操作单抗以0.1mol/L的碳酸盐缓冲液（pH9.5）稀释成10μg/ml加入反应板中，每孔0.2ml，置于湿盒中4℃过夜。0.05%Tween—20，0.0

3、1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4，Tween—PBS）洗3次后加入用0.4%BSA—PBS稀释的待测血浆或培养液上清，每孔0.2ml，37℃温育2小时。同前洗涤3次后，加入用同上缓冲液稀释的酶标vWF单抗，每孔0.2ml，37℃温育2小时。第十三章第一节血管壁的止血作用及检验vWF:Ag操作同前洗涤5次后，每孔加底物溶液（OPD1mg/ml，用0.1ml/L，pH4.5的枸橼酸盐缓冲液配制，30%过氧化氢0.5μg/ml）0.2ml，置室温约5分钟后，各孔加3mol/L硫酸0.05ml终止反应。室温放置10min后在酶标仪上测定492nm

4、处的吸光度值。绘制标准曲线正常混合血浆以0.4%BSA—PBA按1：20、1：50、1：100、1：200、1：500、1：1000六种浓度稀释，与待测样品在相同条件下测定。第十三章第一节血管壁的止血作用及检验参考值：61.6%～126.6%注意事项对血浆vWF：Ag浓度过高的标本，应稀释后再测定。所有ELISA测定中应注意的事项均应引起重视。除本方法外，也可以采用胶乳增强免疫比浊法。第十三章第一节血管壁的止血作用及检验vWF:Ag参考区间vWF:Ag应用评价血管性血友病因子抗原测定主要用于血管性血友病的诊断和鉴别诊断1.减低见于血管性血友病

5、（vWD），是诊断vWD及其分型的重要依据2.升高见于血栓性疾病，如急性冠脉综合征（ASC）、心肌梗死、脑血管病变、妊娠高血压综合征、肾小球疾病等，同时也见于剧烈运动后，肾上腺素受体被兴奋等。应用评价以前vWF：Ag定量常采用免疫火箭电泳，由于操作较为复杂，现在少用。ELISA常用于定量检测vWF：Ag，但是胶乳增强的免疫比浊法更为简便快速，而且可以在全自动血凝仪上进行测定。第十三章第一节血管壁的止血作用及检验凝血酶调节蛋白，TM原理将抗人凝血酶调节蛋白（Thrombomdulin,TM）单克隆抗体包被于聚苯乙烯放免小杯中，样本中的TM结合于

6、包被的放免小杯上，加入125I-抗人TM单抗，根据结合的125I放射性强度计算出样品中TM的含量。第十三章第一节血管壁的止血作用及检验TM操作1.绘制校正曲线人TM标准品用缓冲液A做倍比稀释，TM的浓度分别为500，250，125，31.25，15.6，7.3,3.9和0ng/ml,以人TM浓度为横坐标，以cpm为纵坐标绘制校正曲线。2.将200μl的抗人TM单抗包被液加入聚苯乙烯放免小杯中，4℃过夜，用洗涤液A洗3次，将待测样本（或标准品）0.25ml与等量缓冲液A混合，每小杯加入20μl稀释样品液（空白管加入缓冲液A），37℃水浴2h，用

7、洗涤液A洗3次，加入200μl125I-抗人TM单抗，37℃水浴2h，再用洗涤液B洗六次，在γ闪烁测定仪上测定放射活性，在校正曲线上查出相应的浓度。TM参考区间25～52μg/L第十三章第一节血管壁的止血作用及检验TM是由血管内皮细胞合成和分泌释放的，它表达于血管内皮细胞表面，和循环血液中的凝血酶形成1：1的TM-凝血酶复合物，此复合物将蛋白C（PC）激活为活化蛋白C（APC），APC有灭活FⅧa、FⅤa和激活纤溶活性的作用，因此TM对于血管的抗凝作用十分重要。正常情况下，血浆中TM的含量很低，但当血管内皮受损后，血浆中的TM含量明显升高且与

8、内皮的损伤程度相关。目前认为，TM:Ag的检测是了解血管内皮损伤最好的指标。TM:Ag的水平升高见于血栓性疾病，如糖尿病、心肌梗死、脑血栓、深静脉血栓形成（DVT）