《生物制药技术三》ppt课件

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1、第三章细胞工程制药细胞工程(cellengineering)是指应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的理论与方法，按照人们的需要和设计，在细胞水平上的遗传操作，并通过细胞融合、核质移植、染色体或基因移植以及组织和细胞培养等方法，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。1665年英国物理学家胡克用自制的显微镜发现了细胞.胡克所用的显微镜及观察的栎树细胞壁1674年荷兰科学家列文虎克才真正观察到了细胞细胞是一切生命活动的基本结构和功能单位。第一节细胞融合细胞融合（cellfusion)，又称体细胞杂交（somatichybridiazation），是

2、指两个或更多个相同或不同细胞通过膜融合形成单个细胞的过程。一、细胞融合的定义广义：细胞融合是指用人工方法使两种或两种以上的体细胞合并形成一个细胞，不经过有性生殖过程而得到杂种细胞的方法。狭义：Muller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(

3、1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。20世纪80年代出现了电融合技术。二、细胞融合研究进展生物种类细胞来源成功年代烟草两个种间苷蓝——青菜大豆——马唐草矮牵牛——龙面花大麦——花生大麦——大豆小麦——矮牵牛油菜——大豆玉米——大豆大豆——野豌豆大麦——蚕豆大豆——草香木犀酵母菌——鸡大豆——烟草大豆——秋水

4、仙人——胡萝卜番茄——马铃薯人——小鼠叶——叶叶——根愈伤组织——叶叶——花瓣种子——种子叶——悬浮细胞叶——花瓣叶——悬浮细胞叶——悬浮细胞悬浮细胞——悬浮细胞叶——根悬浮细胞——叶原生质体——血红细胞悬浮细胞——叶悬浮细胞——叶腹水癌细胞——原生质体叶——根尖纤维肉瘤细胞——畸胎瘤细胞197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972几种细胞融合成功的例子植物融合细胞成长状态对比,右瓶为地面融合的细胞，左瓶中为太空微重力环境下融合的细胞动物细胞融合实验使用的小白鼠三、细胞融

5、合的意义理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，从而产生新的核外遗传系统。四、细胞融合的方法诱导细胞融合的方法有3种:生物方法(常用仙台病毒)化学方法(常用聚乙二醇)物理方法(电激和激光)1、仙台病毒法①两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近；②通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透；③两个原生质体的细胞核互相融合，两个细胞融为一体；

6、④进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段：病毒促使细胞融合的主要步骤如下：①两种细胞在一起培养，加入病毒，在4℃条件下病毒附着在细胞膜上。并使两细胞相互凝聚；②在37℃中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需要Ca2+和Mg2+，最适PH为8.0一8.2；③细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP；④融合成巨大细胞，仍需ATP。用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图聚乙二醇(PEG)结构为：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于200小于6000者均可用作细胞融合剂。PEG浓度以W/

7、W；如将10克PEG与10mlEagLe氏液混合（假定1ml培养液为1g重)，即成50％PEG溶液。PEG经高压灭菌后，与温热的Engle氏液混合。通常用分子量低于1000的PEG作融合剂最好，50％PEG溶液能产生最多杂交细胞。PEG溶液在pH6.0时细胞融合率最高。2、聚乙二醇（PEG）法聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程PEG的作用机理：由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在在质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也