《生化基础法医学》ppt课件

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1、第三章：法医物证DNA分析的生化基础伍新尧法医物证检验：分析检材中的“个人特征”——“遗传特征”(GeneticCharacters)，群体/个体的关系——“遗传多态性”的个人特征遗传标记的分类1.蛋白质类：糖蛋白－RBC表面抗原WBC—HLA血清蛋白型同工酶型结构蛋白－外貌特征2.核酸类：DNARNA(mRNA,miRNA)多态性遗传标记遗传多态性的定义：遗传特征在个体间存在的差异。按基因座为单位，低频等位基因的频率³0.01。遗传多态性的分类和各自的特点；不同遗传多态性的检测方法；表型举例肤色（

2、黑色）－－显性耳垂（有）－－－显性斜视（中国人）－显性直发（东方人）－显性趾蹼－－－－－－显性眼睑下垂－－－－显性多指－－－－－－显性湿耳垢－－－－－显性检验个体遗传特征的相关技术1.PCR2.杂交(hybridization）3.酶切(restrictionendonucleasedigestion)4.测序(sequencing)5.标记(labeled)6.电泳(electrophoresis)7.染色(staining)或显色(display)8.基因重组(DNArecombination)

3、9.计算机搜索比对生化与分子生物学基础1．生物界中心法则:DNA—âRNA—âProtein2．蛋白质的特性酶、同工酶、酶促反应（酶与底物的特异性关系）3．核酸(DNA,RNA)的基本特性：碱基配对，可以变性«复性Tm（变性一半的温度）=4(G+C)+2(A+T)℃（meltingtemperature）(20bp左右的核酸片段的Tm值计算公式)溶液离子强度，变性剂，单链吸附现象。4．核酸5‘端可以被标记：标记物(放射性、非放射性)，标记要点，显示方法的差异。5．限制性核酸内切酶（识别特异性序列）、

4、特点、意义。6．遗传变异的分子基础：突变、重组、转座子、(精子或卵子成熟过程)的交换重组7．基因工程技术：杂交（要探针），测序技术（要引物），重组（加上调控序列，promoter,可构成新的遗传物质），8．DNA·chip：DNA分子的固定技术9．基因工程技术引起的伦理学问题。DNARNA转录、剪接、重排蛋白质翻译调控反转录逆转录病毒反义治疗抗生素化疗放疗化疗放疗核酶microRNA复制蛋白质构像的改变-疯牛病（月元）中心法则蛋白质的特性（毛发、精子、指甲等含胱氨酸量高，胱氨酸（-S-S-）由两个半

5、胱氨酸脱氢（氧化）后形成,加入b-巯基乙醇还原后变成半胱氨酸（—SH），才易受蛋白酶分解。2.蛋白质具有两性性质，等电点（pI）偏酸的溶液中带正电，反之带负电；可以电泳分离；3.加热、加入乙醇、强酸强碱、重金属离子或生物碱等试剂可以使其变性；（酶的活性丧失）4.有4级结构，可以成为抗原，刺激产生抗体；5.酶（包括限制性核酸内切酶）属蛋白质，其催化功能依赖完整的酶蛋白功能域（domain），底物有高度专一性，要求最适温度和最适pH，有激活剂和抑制剂。大多数酶在40℃以上会失活。（保存条件严格：4℃以下

6、，反复冻融使活性丧失）；TaqDNA聚合酶例外。碱基配对限制性核酸内切酶（Restrictionendonuclease）单链多肽，最适pH为6～8，NaCl有抑制作用，被Mg2+激活，巯基有保护作用，对热不稳定，于含50％甘油的缓冲液－20℃保存；识别序列多为回文结构，水解磷酸二酯键，切端分平头（钝端）和突出（黏性）末端两种;回文可以倒读，举例：池莲照晓月，幔锦拂朝风。风朝拂锦幔，月晓照莲池。限制性核酸内切酶举例（DNA指纹检测和Am-RFLP时用）切出粘端HpaII5’---G¯CGC---3’

7、BamH15’---T¯CCGGA---3’EcoR15’---G¯AATTC---3’切出钝端（平端）AluI5’---AG¯CT---3’SmaI5’---CCC¯GGG---3’杂交及其条件（DNA指纹检测和HLA基因检测用)碱基配对的原则，G/C比A/T牢固（意义：退火温度要高）变性«复性的条件单链DNA的特性－吸附在硝酸纤维素膜(nitrocellulosemembrane)或尼龙膜(nylonmembrane)上杂交条件的严谨性（温度+、离子强度-、洗涤次数+）DNA复制的条件（细胞中/

8、试管中比对）单链DNA模板－（解链酶、DNA拓扑异构酶）引物的特异性－20bases（细胞中引物酶合成RNA引物）DNA聚合酶（细胞中的DNA聚合酶III）,效率2500bp/s原料－dNTPs合适的溶液（Mg2+）DNA复制的方向：5’®3’检测基因产物多态性的局限1．基因产物易受外界因素干扰，不能持久（蛋白质结构，抗原决定族等易受破坏，改变，酶活性中心失活）2.技术上的先天不足HLA的Ab与Ag各自都有广泛的交叉反应。使定型困难，或无法解释。3.遗传变异ABO血型