《cr技术培训讲座》ppt课件

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1、PCR技术培训疾病的诊断分子诊断影象学诊断细胞/组织诊断临床诊断免疫诊断生化诊断几乎所有的疾病都是基因病科学研究已证明，基因可以揭示疾病的本质，人类几乎所有疾病都直接或间接与基因有关，在某种意义上都是基因病，基因（gene）：基因是有遗传效应的DNA片段，是控制性状的遗传物质的功能单位。遗传效应是指能转录为mRNA，继而翻译为蛋白质，或转录为核糖体RNA．转运RNA的功能。PCR技术1985年美国人莫里斯（KaryMullis）发明了一种模拟DNA体内复制过程，在体外复制特定DNA片段的方法，并将其命名为聚合酶链式反应（PolymeraseCha

2、inReaction，PCR）。PCR可以在短时间内倍增极微量DNA（理论上说,仅有一个足够了）至百万或十亿倍，通过PCR可以简便、快速地从微量生物材料中获得大量特定的核酸，并具有很高的灵敏度和特异性，可用于微量核酸样品的检测。PCR技术PCR技术被科学界誉为生物技术领域最伟大的发明之一，美国人莫里斯在发明该技术不久就因此于1993年获得诺贝尔化学奖。PCR及其相关技术于80年代末在国外开始应用：欧共体（现欧盟）、日本、美国相继把PCR这一基因诊断核心技术列入献血员筛查，美国食物与药品管理局已批准了60多种基因诊断试剂用于临床，美国国家疾病控制中

3、心已把PCR技术列入疾病诊断的常规技术。1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。标准的PCR过程分为三步荧光PCR检测技术是在传统PCR技术基础上，加入荧光标记的基因探针，通过探针与扩增产物的结合释放出荧光信号，再通过专门的

4、仪器（荧光PCR仪）对荧光信号的实时检测，经过电脑分析以后，可以准确计算出目的基因的初始数量，实现定量检测。与传统PCR检测相比，荧光PCR检测技术不仅实现了PCR检测从定性到定量的飞跃，而且它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。因此，荧光PCR检测技术自二十世纪九十年代中期出现以来，已成为最具代表性的PCR检测技术，为PCR检测技术临床应用打开了方便之门，现已得到广泛应用。荧光PCR检测技术简介短柄圆环探针荧光PCR原理分子信标是一种荧光标记的寡核苷酸链，一般含有25～35个核苷酸。在结构上，分子信标大体上可以分为三部分

5、：（1）、环状区：一般由15～30个核苷酸组成，可以与靶分子特异结合；（2）、茎干区：一般由5～8个碱基对组成，在分子信标与靶分子结合过程中可发生可逆性解离。（3）、荧光基团和淬灭基团：荧光基团一般连接在5ˊ端；淬灭基团一般连接在3ˊ端，常用4-（4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）作为淬灭基团。根据Foerster理论，中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比。所以只有荧光基团与淬灭基团之间达到一定的距离时才会产生荧光。荧光标记荧光发光是通过激发光激发荧光基团到达高能量状态,而后产生发射光。常用的有绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光

6、蛋白DsRed、CY3、CY5、FAM及其它荧光报告基团探针荧光标记及荧光基团：如红色荧光Cy3和绿色荧光Cy5标记探针淬灭基团常：用4-（4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）影响分子信标的主要因素分子信标中，荧光基团和淬灭基团之间的距离是影响分子信标的最主要因素。根据Foerster理论，荧光基团与淬灭基团之间的距离直接影响荧光的强度。另外，温度也是影响分子信标的一个重要因素。在较低温度下，分子信标才可以保持发卡结构。在较高温度下，分子信标将无法保持其发卡结构，甚至使其伸展为随机线状，造成荧光基团和淬灭基团分离，从而发出荧光，出现假阳

7、性结果。有文献表明，其熔链温度取决于茎干区的长度、G-C含量和缓冲液的离子强度试剂盒组成1、痰DNA提取液2、PCR反应液结核引物1和2、结核探针、TaqE、缓冲液（10mmol/LTris-HCl）、dNTP、内参照模板、内参照引物1和2、内参照探针、石蜡油3、PCR增强剂：MgCl24、强阳性对照：结核杆菌阳性质粒（或卡介苗）5、弱阳性对照：结核杆菌阳性质粒（或卡介苗）6、阴性对照：超纯水PCR反应特点特异性强灵敏度高PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=-6)水平。能从100万

8、个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。简便、快速PCR反