《CR技术讲座》PPT课件

《《CR技术讲座》PPT课件》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、PCR技术及其应用谨以此与零点的朋友们交流学习ContentsPCR原理及其分类1常规PCR体系配制与程序设置2不同PCR引物设计原则3PCR:（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应在体外模拟体内DNA复制的环境配制适当的缓冲体系然后加入各种组分:模板DNA，四种核苷酸，Mg2+,DNA聚合酶，上下游引物，通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环来扩增模板DNA。每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;扩增了特异区

2、段的DNA带。PCR基本原理PCR扩增原理引物延伸延伸5’5’3’3’变性、退火变性、退火1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍1）不对称PCR目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板制备

3、杂交探针基因组DNA结构功能的研究高浓度引物低浓度引物2)反向PCR(reversePCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。已知序列未知序列未知序列已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶3）多重PCR用于检测特定基因序列的存在或缺失。电泳引物4）LP-PCR（Labelledprimers)利用同位素、

4、荧光素等对ＰＣＲ引物进行标记，用以直观地检测目的基因。特别适合大量临床标本的基因诊断可同时检测多种基因成分病毒1病毒2病毒3病毒4标记引物ＰＣＲ观察PCR产物5）锚式PCR已知靶基因片段两测的序列6）原位ＰＣＲ原位聚合酶链式反应（InStillPCR，Is－PCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位。

5、适用于检测病理切片中含量较少的靶序列原位PCR的作用既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH），但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下，该方法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列，敏感度很高，但却未能与细胞形态学研究相结合。ISPCR则可把这两者结合起来，成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。7）ＲＴ－ＰＣＲ逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNA

6、cDNA杂化双链PCR扩增基因mRNA蛋白质多肽链8)荧光定量PCRcDNA末端快速扩增技术(rapidamplificationofcDNAends,RACE)是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5‘和3’末端的有效方法。经典的RACE技术是由Frohman等(1988)发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5’和3’端，包括单边PCR和锚定PCR9）RACE技术cDNA末端核酸转移酶3’GG…GG5’CC…CC锚定引物3’GG…GG5’CC…

7、CC3’GG…GGCC…CC锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对的3’锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增巢式PCR（nestedPCR），是指利用两套PCR引物（巢式引物）对进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在在内引物的存在下进行第二轮扩增。由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；又有两对PCR引物与检测模板的配

8、对，增加了检测的可靠性。10)巢式PCRPCR体系配制与程序设置标准的PCR反应体系4种dNTP混合物各200umol/L上下游引物　　各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L1）PCRbuffer:500mMKCl,100mMTris-HCl(pH9.0，25℃),1%TritonX-100主要是为反应提供相应的离子环境和酸碱环境2）dNTP提供原料3）Mg2+Taq