生物制药工艺学第12章制备型HPL

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1、第十二章制备型高效液相色谱制备型高效液相色谱的用途:1重组蛋白药物生产的工艺优化、中试以及大规模生产的必备手段。2天然产物中活性物质发现的重要手段:蛋白质,多肽,多糖。抗菌肽3从天然产物来源药品生产的重要手段:胰岛素,蕲蛇酶。4实验室制备样品用于临床试验和报批。5在2-D电泳,blotting,ELISA等之前的样品制备。第一节高效液相色谱法简介1.1液相色谱的发展史1903年,色谱法问世。俄国植物学家茨维特1903年3月21日,大会报告“一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用”1906年在德国植物学杂志发表文章

2、,首次命名上述分离后色带为色谱图,称此方法为色谱法1931年,库恩(Kuhn)分离胡萝卜素,1938年,Kuhn和Lederer从维生素B中分离出B6,获得了1938年的诺贝尔化学奖。1941年,马丁(Martin)和辛格(Synge)提出液液分配色谱法,1952年度的诺贝尔奖。60年代末,70年代初,高效液相色谱仪的成功研制高效填料,高压泵,仪器检测1.2基本仪器装置输液系统进样系统分离系统检测系统收集系统数据处理系统21高效液相色谱仪组成1输液系统(1)高压输液泵作用:将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统

3、。输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。(2)在线脱气装置作用:脱去流动相中的溶解气体。流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。超声脱气、真空脱气等脱气不好时有气泡,导致流动相流速不稳定,造成基线飘移,噪音增加。PressureDampersO2,N2,CO2…(3)梯度洗脱装置Isocraticelution恒定组成的单一溶剂体系Gradientelution以一定速度改变多种溶剂的配比淋洗,目的是分离多组容量因子相差较大的组分High-PressureMixing2进样系统六通阀3分离系统3.1色谱柱

4、3.2色谱柱填料sphericalandirregularsilicaparticlesMacroporoussphericalsilicaparticle.[K.K.Unger,Poroussilica,Elsevier,1979]基质:载体或担体。数m~数十m,球形。硅胶或有机高分子聚合物PellicularparticlePorousparticle30-50m1-2m3-10m3.3色谱柱填料功能层:物理吸附或化学键合检测系统:收集系统:数据处理系统:三、高效液相色谱法的特点采用高效色谱柱、高压

5、输液设备和高灵敏度检测器,从而实现了高效、高速、高灵敏度和定量准确。和经典液相相比有以下优点:快速、灵敏度高、分辨率高、自动化程度高等。四、制备型高效液相色谱与分析型高效液相色谱法的区别输液泵不同:两种泵设计的特点及其性能AKTAprimeAKTApurifierAKTAxpress系统泵及样品泵泵型:单泵流速:0.1-50ml/min泵压:1Mpa增量:0.1ml/min粘度:10cp泵型:双泵4泵头高效柱塞泵流速0.001-10ml/min泵压:25Mpa流速精度<±2μl/min增量:0.001ml/min

6、粘度:5cp泵型:高效柱塞泵流速:0.1-65ml/min泵压:3Mpa检测器中的检测池不同:体积不同色谱柱不同:规格主要是直径,粒径的大小制备色谱一般配有电导检测器和pH值检测器分析型色谱没有:制备色谱一般配备收集器分析型色谱没有五、色谱的基本理论及有关参数两大理论:塔板理论(theplatemodel):阐明了色谱、蒸馏和萃取之间的相似性,将色谱柱设想成由许多液液萃取单元或理论塔板组成;相似于精馏过程,色谱分离也是一个分配平衡过程.N=16(tR/wb)2N=5.54(tR/w1/2)2速率理论:研究各种动力

7、学因素对峰展宽的影响。H=A+Cu有关参数容量因子:溶质在固定相中的总摩尔数与流动相中总摩尔数之比。容量因子k与柱效参数及定性参数密切相关,而且比分配系数易于测定,在色谱分析法中一般都是用容量因子代替分配系数。选择因子(selectivityfactor,α):相邻两组份的分配系数或容量因子之比。设k2>k1,则α=k2/k1,所以α又称为相对保留时间(《美国药典》)。要使两组分得到分离,必须使α≠1。α与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关,与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说,α的大小表示两组份

8、在两相间的平衡分配热力学性质的差异,即分子间相互作用力的差异。分离度:在色谱过程中表示两组分相互分离的程度,一般情况下,分离度大于1.5时称分离完全.只有峰窄而间距大的分离是令人满意的。在色谱分析中要求:两组分的保留值差别要足够大。两色谱峰要足够窄。待测组分的分离度要足够大,分离过程要尽可能短.六、制备型高效液相色谱的重要参数:Capacity:纯化过程中,目标物质的上样

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