生物制药工艺学第7章凝胶层析

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1、第七章凝胶层析(Gelchromatography)分子筛层析(molecularsievechromatography)凝胶过滤(Gelfiltration)排阻层析(exclusionchromatography)将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相，由于各组分流经体积的差异，使不同分子量的组分得以分离的层析方法。1洗脱曲线2第一节凝胶层析原理凝胶层析的分离过程是在装有多孔物质填料的柱中进行的。柱的总体积为Vt，它包括填料的骨架体积Vg，填料的孔体积Vi(内水体积)以及填料颗粒之间的体积V0（外水

2、体积）。Vt=Vi+V0+Vg34一、原理当具有一定分子量分布的高聚物溶液从柱中通过时，较小的分子在柱中停留时间比大分子停留的时间要长，样品各组分即按分子大小顺序而分开，最先淋出的是最大的分子。Ve=V0+ViKdflash5二、凝胶层析的几种理论（一）平衡排除理论（二）扩散分离理论（三）流动分离理论6（一）平衡排除理论当溶质层流过一个填料颗粒这段距离时，溶质分子已多次进出于填料的孔，达到平衡。平衡条件是在流速很慢时的一个极端情况。7（二）扩散分离理论溶质分子在流经凝胶柱的过程中，在流动相和固定相之间

3、没有达到平衡，存在着流速依赖性。聚苯乙烯和苯乙烯样品淋出曲线的流速依赖性1．流速为0.65ml/min；2．流速为2.0ml/min溶剂为甲苯8（三）流动分离理论红细胞在毛血细管中流动时比血浆流得快.较大的分子较先通过或绕过这个填料颗粒，使溶质能按其大小进行分离。9分离过程三种不同分子量物质的混合样品用某种规格的凝胶柱进行分离。样品加入，以水或其他溶液进行洗脱，即得洗脱曲线。10分离过程最先流出物质A，A分子量最大，只能从颗粒间隙流过，“全排阻”。其流经体积最小，等于外水体积V0。最后流出物质C，它分

4、子量最小，“全渗入”。流经体积是外水体积与内水体积之和V0+Vi。物质B分子量介于渗入限与排阻限之间。“部分排阻”或“部分渗入”。流经体积Ve是全部外水体积加上内水体积的一部分，即Ve=V0+KdVi11三、分配系数Kd排阻系数：当Kd=1时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。当Kd=0时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。0＜Kd＜1时，洗脱体积Ve=Vo+KdVi，为部分渗入。12物质的Kd值13Kav有效分配系数14过柱法测定V0及ViVe=Vo+KdVi如用全排阻（Kd=0）或全渗入（Kd=1）

5、的物质过柱，测量其洗脱体积，计算该凝胶柱的V0值及Vi值。蓝色葡聚糖（Kd=0）重铬酸钾（Kd=1）15分配系数测定Kd16思考题已知两种蛋白在SephadexG-100上的Kd(如血清白蛋白Kd为0.2，细胞色素C为0.7)，通过Kd的大小我们能得到哪些信息？17四、凝胶层析的特点（1）凝胶层析操作简便，所需设备简单。（2）分离效果较好，重复性高。（3）分离条件缓和。（4）应用广泛（除盐，分子量测定，分离纯化）。（5）分辨率不高，分离操作较慢。1819第二节凝胶的结构和性质一、葡聚糖凝胶(Sepha

6、dex)二、修饰葡聚糖凝胶(ModifiedSephadex)三、聚丙烯酰胺凝胶（Bio-GelP）四、琼脂糖类凝胶（Sepharose）五、多孔玻璃微球(Bio-glas)六、疏水性凝胶（hydrophobicgels）20一、葡聚糖凝胶(Sephadex)商品名为SephadexG类.交联葡聚糖的基本骨架是葡聚糖。再经3-氯-1，2-环氧丙烷为交联剂，形成三维网状结构的高分子化合物。其交联度是通过交联剂的加量及反应条件来控制的。21SephadexG编号间接反映：1、吸液量；2、溶涨时间；3、凝胶

7、孔径；4、分离范围22葡聚糖凝胶性能与编号的关系编号交联度吸液量膨胀速度凝胶孔径分离限凝胶强度大（SephadexG－150）小大慢大大小小（SephadexG－50）大小快小小大23葡聚糖凝胶（G类）的规格24思考题用葡聚糖凝胶分离蛋白质与多糖时，其分离范围不同，为什么？25葡聚糖凝胶（G类）特点1、孔径。2、稳定性。3、吸附作用。4、芳香族化合物和杂环化合物。26保存保存的方法有干法、湿法和半缩法三种。湿法：加入一定量的防腐剂置于冰箱中作短期保存（6个月以内）。常用0.02%叠氮化钠、0.02%三

8、氯叔丁醇、20%乙醇等。27二、修饰葡聚糖凝胶(ModifiedSephadex)（一）亲脂性葡聚糖凝胶（LipophilicSephadex）骨架结构上引入一些有机基团，如甲基、羟丙基，使呈亲脂性，同时保留亲水性。（二）交联葡聚糖离子交换剂（Sephadex–ion-exchanger）将活性交换基团连接于葡聚糖凝胶上制成的各种交换剂。28交联葡聚糖离子交换剂29（三）Supperdex系凝胶由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合而成。（四）Sephac