第5章 凝胶过滤层析

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1、第五章凝胶过滤层析2第五章凝胶过滤层析3第五章凝胶过滤层析4第五章凝胶过滤层析5第五章凝胶过滤层析6第五章凝胶过滤层析Fig.4.11ElutioncurveofSAPbyHiLoad16/60Superdex75pg7第五章凝胶过滤层析8第五章凝胶过滤层析第一节概述第二节基本原理第三节凝胶过滤介质第四节凝胶过滤方案设计第五节层析技术（操作过程）第六节凝胶过滤层析的应用第五章凝胶过滤层析9第五章凝胶过滤层析第一节概述10第五章凝胶过滤层析层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家MichaelTswett(茨维特)发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的

2、柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”(Chromatography)。11第五章凝胶过滤层析层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。层析法的基本原理12第五章凝胶过滤层析(1)按流动相的状态分类：用液体作为流动相的称为液相层析，或称液相色谱；以气体作为流动相的称为气相层析，或称气相色谱。(2)按固定相的使用形式分类：可分为柱层析(固定

3、相填装在玻璃或不锈钢管中构成层析柱)、纸层析、薄层层析、薄膜层析等。(3)按分离过程所主要依据的物理化学原理分类：可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析、分子排阻层析、亲和层析等。层析技术的分类13第五章凝胶过滤层析14第五章凝胶过滤层析15第五章凝胶过滤层析第二节基本原理16第五章凝胶过滤层析凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析、凝胶渗透层析。凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析。5.2.1概念与原理17第五章凝胶过滤层析18第五章凝胶过滤层析凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，当样品溶液通过凝胶柱时，相对分

4、子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，因此流程较短，向前移动速度快而首先流出层析柱；原理：19第五章凝胶过滤层析相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可自由地进出凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，它们从凝胶内扩散到胶粒孔隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入与逸出，使流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱。20第五章凝胶过滤层析而中等大小的分子，它们也能在凝胶颗粒内外分布，部分进入颗粒，从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。这样，经过层析柱，使混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。21第五章凝胶过滤层析l分子大小不

5、同混合物上柱；2洗脱开始，小分子扩散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；3大小分子分开：4大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中22第五章凝胶过滤层析5.2.2目标组分的分子量、形状关于GF分级范围凝胶的分级范围（渗入限与排阻限）相对分子量>分级范围上限——全排阻分子，流程最短，无法分离相对分子量<分级范围下限——全渗透分子，流程最长，无法分离分级范围下限<相对分子量<分级范围上限——部分渗透分子，流程长短不一，有效分离23第五章凝胶过滤层析相对分子量相同，形状不对称者倾向于被阻挡在凝胶颗粒网孔之外，保留时间短于对称者分级范围参数：球状分子&纤维状分

6、子例：SephadexG-75：3000~80,000&1000~50,000分子形状影响有效分离24第五章凝胶过滤层析5.2.3层析柱的重要参数凝胶柱体积参数Vt=Vo+Vi+Vg25第五章凝胶过滤层析Vt—柱床体积Vo—外水体积；颗粒间隙的液相体积总合Vi—内水体积；颗粒网孔内液相体积总合Vg—凝胶体积；颗粒固相总体积，干胶总体积Vt=Vo+Vi+Vg26第五章凝胶过滤层析柱体积柱体积是指凝胶装柱后，从柱的底板到凝胶沉积表面的体积。在色谱柱中充满凝胶的部分称为凝胶床，因引柱体积又称“床”体积，常用Vt表示。27第五章凝胶过滤层析外水体积简称为外水体积，Vo等于

7、被完全排阻的大分子的洗脱体积。可以用一个已知相对分子质量远超过凝胶排阻极限的有色分子，如常用的蓝色葡聚糖-2000（二百万）溶液通过柱床，即可测出柱床的外水体积Vo。28第五章凝胶过滤层析内水体积Vi简称内水体积，可由g·Wr求得（g为干凝胶质量，单位为g，Wr为凝胶吸水量，以mL／g表示）。Vi也可以从洗脱一种完全不受凝胶微孔排阻的小分子溶质（如重铬酸钾）的洗脱体积计算29第五章凝胶过滤层析洗脱体积和分配系数洗脱体积(elutionvolume,Ve)—自样品加至层析柱上部开始，至洗脱组分达到最大浓度（对应洗脱峰峰顶）时流经层析柱的洗脱液的总体积。30第五章凝胶

8、过滤层析洗