生物制药工艺学第10章离心技术

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1、第九章离心技术本章要求：基本概念：离心力，相对离心力，沉降速度，沉降系数。掌握：相对离心力的计算螺旋卸料离心机的特点影响沉降速度的因素制备型离心机常用的转子差分离心法速度区带离心法及其特点，等密度离心法及其特点.密度梯度离心常用的介质有哪几类：密度梯度的制备方法梯度的回收方法了解：分析型离心技术：第一节基本原理和设备一、沉降和离心沉降作用：悬浮液静置时，在重力作用下，密度大于周围溶液的固体颗粒逐渐下沉。漂浮作用：影响沉降的因素：颗粒大小、颗粒密度、溶液黏度离心技术:利用旋转产生的离心力代替重力，加速固体沉降速度的一种分离方式。离心技

2、术有多种形式：1．离心沉降2．离心过滤3．离心分离4．离心分析二离心力1离心力（centrifugalforce，Fc）：在一定角度速度下作圆周运动的任何物体都受到的向外的力。离心力（Fc）的大小等于离心加速度ω2r与颗粒质量m的乘积，即：F=mω2r⒉相对离心力（relativecentrifugalforce，RCF）由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，在相同转速下离心力会变化，RCF就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。式中r为离心转子的半径距离，以cm为单位；g为地球重力加速度（980cm/sec2）；

3、N为转子每分钟的转数（rpm）。三沉降速度即在离心力作用下，物质粒子于单位时间内沿离心力方向移动的距离。四沉降系数在单位离心力场中，颗粒的沉降速度谓之“沉降系数”五沉降时间六转子常数七分子量计算八、离心机（一）离心机的分类1．按转速高低及是否有冷冻来分（1）普通离心机，小于6000rpm（2）高速离心机，8000-25000rpm（3）超速离心机，25000-80000rpm2．按结构分类（1）台式离心机（2）立式离心机（3）沉降式离心机（4）转头式离心机（5）电动式离心机3．按工作性质分类（1）制备型离心机（2）实验室用离心机，4

4、．按操作方式分类（1）连续离心机。（2）人工卸料（出渣）离心机；（3）自动卸料离心机（如螺旋式离心机）（二）常用离心机1普通离心机2管式高速离心机原理：应用：液固，液液，发酵工程酶工程中分离菌体3蝶片式离心机4离心过滤机5卧式螺旋卸料沉降离心机6冷冻高速、超速离心机第二节制备型超离心技术一、离心设备（一）转子1角度转子2水平转子3区带转子4垂直管转子5连续离心转子6细胞洗脱转子（二）离心管由管体和盖组件两部分组成二、离心方法差分离心（离心沉降）、密度离心法（离心分离）（一）差分离心概念：差分离心法亦称为“差速离心法”，是依据不同大小

5、和密度的颗粒在离心力场中沉降速度的不同进行离心分离的一项技术。过程是将样品溶液在一定离心力场中离心一定时间使颗粒大组分沉降于管底，上层液再用加大的离心力场离心一定时间，又可获得中等大小的组分。如此依次提高离心力，逐级分离出所需组分，故称其为差分离心法。用途：差速离心的分辨率不高，沉降系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于颗粒或密度差别较大的组分的分离，或其他分离手段之前的粗制品提取。（二）速度区带离心法概念：又称速率区带离心法或分级区带离心法。离心操作时将样品液置于连续或不连续，线性或非线性密度梯度液上（如蔗糖、甘油、KB

6、r、CsCl等），控制离心时间，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，从而达到彼此分离的目的。这种离心方法称速度区带离心法。特点：（1）样品加于梯度介质的顶部、离心时间须严格控制。（2）介质的密度亦须严格掌握：梯度最大值≤组分最小密度。（3）样品的密度＜梯度密度最小值。（4）分离依据是各组分之沉降系数差。（5）分辨率受组分沉降系数，离心时间，颗粒扩散系数，介质粘度及梯度范围和形状的影响。用途：本法适于分离颗粒大小不同而密度相近或相同的组分，如DNA与RNA混合物、核蛋白体亚单位及线粒体、溶酶体及过氧化物酶体等

7、。Ficoll密度梯度离心法分离外周血单核细胞(一)原理:红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞离心后漂浮于分层液的液面上，吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单核细胞。(二)方法:1.在短管中加入适量细胞分离液。2.取肝素抗凝静脉血，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。离心2000rpm×20分钟。3.离心后管内分为三层，上层为血浆，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。4.用毛细血管插到云雾

8、层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入５倍以上体积的Hank's液或RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。（三）等密度离心法概念：离心力作用下，不同密度的多组分颗粒在梯度介质中“向上”或“向下”移动，当移动至其