生物分离工程第三章生物大分子的初级分离技术

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1、第三章、生物大分子的初级分离技术3学时总体学习目的和要求了解蛋白质表面特性，掌握各种沉淀和泡沫分离的原理、特点以及应用范围。目录引言沉淀分离蛋白质表面特性盐析沉淀等电点沉淀有机溶剂沉淀热沉淀其他沉淀法沉淀生成动力学泡沫分离一、引言－学习要点识记：初级分离概念理解：初级分离特点初级分离概念初级分离是指从发酵液、细胞培养液、胞内抽提液（细胞破碎液）及其他各种生物原料初步提取目标产物，使目标产物得到浓缩和初步分离的下游加工过程。初级分离特点分离对象：体积大、杂质含量高；分离技术：低操作成本、适于大规模生产二、沉淀分离－学习要点识记：盐析和盐溶概念理解：蛋白质凝集沉淀的屏障，各种沉

2、淀方法的原理和影响因素应用：采用不同的试剂方法实现蛋白质的沉淀沉淀的定义由于物理环境的变化而引起溶质溶解度的降低、生成固体凝聚物的现象，称为沉淀。沉淀与结晶的区别沉淀生成的固体颗粒是不定形的结晶产品为单一组分，而沉淀凝聚物则成分非常复杂（除了目标产物外，还夹杂着多种共存的杂质、盐和溶剂等）沉淀的纯度远低于结晶多步沉淀操作也可获得高纯度的目标产品沉淀技术适用范围沉淀分离在生物分离过程中应用相当广泛。一般情况下，沉淀分离方法在生物下游加工过程中通常作为初级分离技术加以使用，但在实际过程中也有仅通过沉淀分离得到目标产品的工业实例。蛋白质表面特性－蛋白质组成蛋白质组成20种氨基酸构

3、成的两性高分子电解质，包括疏水性氨基酸和亲水性氨基酸蛋白质折叠趋势疏水性氨基酸：向内部折叠的趋势亲水性氨基酸：分布于蛋白质外表面的趋势结果在蛋白质三维结构中仍会有部分疏水性氨基酸残基暴露于表面，在蛋白质表面形成一定的疏水区胶体的定义胶体是一种尺寸在1～100nm以至1000nm的分散体。它既非大块固体，又不是分子分散的液体，而是具有两相的微不均匀分散体系。-《被遗忘了尺寸的世界》WilhelmFriedrichOstwald(1853–1932)胶体的性质比表面增大，界面现象重要强烈的尺寸效应蛋白质表面特性－蛋白质性质蛋白质的胶体性质蛋白质的分子量约6～1000kDa，分子

4、直径约为1~30nm。在此粒径范围内，蛋白质可视为胶体，并表现出胶体溶液的部分性质蛋白质的两性电离和等电点蛋白质两端及侧链中有一些解离基，解离程度受pH影响。蛋白质的变性物理因素：加热、加压、脱水、搅拌、振荡、紫外线照射、超声波的作用等；化学因素：有强酸、强碱、尿素、重金属盐、SDS等。蛋白质表面特性－沉淀屏障蛋白质分子周围的水化层水溶液中蛋白质可视为胶粒，其周围存在着稳定的水化层胶粒外的这部分水客观上起排斥作用，称为“水化层斥力”分子间的静电排斥作用根据扩散双电层理论，胶粒是带电的，其表面吸附相反电荷的反离子，这些位于胶粒周围过量的反离子好像胶粒四周为离子氛所包围。当两个

5、胶粒（蛋白质）趋近而使离子氛发生重叠时，处于重叠区内的反离子浓度较大，从而破坏了原有电荷的对称性，引起离子氛中电荷重新分布，即离子从浓度较大的重叠区向未重叠区扩散。这种扩散的结果就是胶粒受到斥力而相互脱离。蛋白质表面特性－沉淀策略及方法策略破坏蛋白质四周水化层降低双电层厚度沉淀方法改变溶液pH值加入无机盐或改变无机盐种类加入水溶性有机溶剂添加脱水剂蛋白质表面特性－常用的沉淀技术盐析沉淀等电点沉淀有机溶剂沉淀聚合物沉淀热沉淀盐析沉淀-学习要点识记：盐析和盐溶概念理解：盐析沉淀的原理，影响盐析的各种因素应用：掌握盐析操作过程盐析沉淀-盐析的定义定义蛋白质在高离子强度的溶液中溶解

6、度降低、发生沉淀的现象称为盐析（Salting-out）溶解度与I的关系－Cohn方程盐析沉淀-盐析原理低离子强度下的盐溶向蛋白质的纯水溶液中加入电介质后，蛋白质将吸附盐离子，而形成扩散双电层（产生分子间相互排斥作用）导致蛋白质的溶解度增大，发生盐溶高离子强度下的盐析溶液主体中那些与扩散层反离子电荷符号相同的电解质离子将把反离子压入（排斥）到双电层中由于盐的水化作用，其将争夺蛋白质水化层中的水分子，使蛋白质表面疏水区脱水而暴露，增大它们之间的疏水性作用盐析沉淀-盐析原理图示盐析沉淀-影响盐析因素蛋白质的分子量和结构无机盐种类和浓度相同离子强度下，不同种类的盐对蛋白质的盐析效

7、果不同盐的种类将影响到Cohn方程中的盐析常数盐的种类对蛋白质溶解度的影响与离子的感胶离子序列相符温度和pH值在低离子强度溶液中，蛋白质的溶解度在一定的温度范围内随着温度升高而增大在高离子强度溶液中，温度的升高利于蛋白质脱水，破坏水化层并导致蛋白质溶解度的降低盐析沉淀-无机盐的选择溶解度大可配制成具有较高离子强度的无机盐溶液溶解度受温度的影响较小盐溶液密度不高，以便蛋白质沉淀的沉降或离心分离。盐析操作-沉淀剂性质对于用于沉淀剂的无机盐试剂，了解其性质，特别是无机盐的溶解性质（溶液密度、饱和浓度等），是必需的。以硫酸