生物信息学表达谱流程简介

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1、表达谱流程简介科学特种兵团RNA线韩祖晶hanzujing@genomics.org.cn数字基因表达谱（DigitalGeneExpressionProfile，DGEP）DGEPDGEDGEII主要流程主推流程实验流程和原理信息分析流程DGE1、DGE实验流程和实验原理：如右图，展示的是DGE的实验流程。从总的RNA样品到mRNA的提取再到cDNA的合成再到Tag的制备最后到上机测序和数据产出。DGE如右图，展示的是DGE的实验原理。利用OligodT的beads富集总RNA中mRNA，并逆转录为双链cDNA，采用4碱基识别酶NlaIII酶切双链cDNA，链

2、接Illuminaadapter1，利用MmeI酶切3’端CATG下游17bp碱基，并在3’端链接Illuminaadapter2。再加入PrimerGX1和PrimerGX2进行PCR扩增。扩增后样本通过6%TBEPAGE胶回收85碱基条带，纯化后通过Illumina基因表达测序。DGE2、DGE信息分析流程：DGE2.1、去除杂质数据原始序列带有一段3’adaptor序列，并且含有少量低质量序列以及各种杂质成分。经过一系列数据处理，得到CleanTag。数据处理的步骤：去除3’adaptor序列：原始read带有一段3’adaptor序列，首先要去除每个re

3、ad的3’adaptor序列；去除空载reads（只含3’adaptor而不含Tag序列的reads）；去除低质量Tag（含有未知碱基N的tag）；去除长度过小过大的Tag，保留长度为21nt的Tag；获得CleanTag。2.2、CleanTag拷贝数分布统计不均一性是细胞mRNA表达的显著特征，少量种类mRNA表达丰度极高，而大部分种类mRNA表达水平很低甚至极低。CleanTags数据中，Tags的拷贝数反映了相应基因的表达量，其分布统计可以从整体上评估数据是否正常。DGEDGE2.3、测序饱和度分析饱和度分析检验随着测序量（标签数量，TotalTagNu

4、mber）的增加，检测到的基因是否随之上升。2.4、实验重复性分析对两次平行实验的结果相关性分析可获得对实验结果可靠性和操作稳定性的评估。DGEDGE2.5、基因表达注释首先，我们根据合作伙伴提供的参考基因数据库（注：对于没有参考基因数据库的物种，可以在同属种中进行同源比对，但结果仅供参考。），利用软件检索mRNA上所有的CATG位点，生成CATG＋17nt碱基的参考标签数据库。然后将全部CleanTag与参考标签数据库比对，允许最多一个碱基错配，对其中唯一比对到一个基因的标签（UnambiguousTags）进行基因注释，统计每个基因对应的原始CleanTag

5、数，然后对原始CleanTag数做标准化处理，获得标准化的基因表达量，从而更准确、科学地衡量基因的表达水平。标准化方法为：每个基因包含的原始CleanTags数/该样本中总cleanTags数*1,000,000(tHoen,Ariyureketal.2008;Morrissy,Morinetal.2009）。DGECleanTag和参考基因、线粒体、叶绿体和参考基因组的比对结果统计DGE2.6、反义转录分析Sense-antisense是基因表达调控的一种重要方式。如果测序标签能比对到基因的反义链，则暗示该基因的反义链也包含转录本(tHoen,Ariyurek

6、etal.2008)，该基因可能存在sense-antisense调控方式。2.7、新转录本预测与芯片相比，应用Solexa表达谱检测基因表达毋须事先设计探针，因此能帮助用户检测出新转录本。我们将不能比对到参考基因和叶绿体、线粒体基因组的cleantag比对到核基因组，给出cleantag能唯一比对上的核基因组区域，研究人员结合自己研究领域的背景知识，可判断相关区域是否存在之前未发现的新转录本(tHoen,Ariyureketal.2008)。DGE2.6、差异表达基因筛选2.7、表达模式聚类分析2.8、GO功能显著性分析2.9、Pathway显著性分析以上分析

7、同DGEII，将在后面讲到。1、DGEII实验流程和实验原理：样品提取总RNA后，对于真核生物，用带有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，对于原核生物，用试剂盒去除rRNA，向得到的mRNA中加入fragmentationbuffer使其片断化成为短片段，再以片断后的mRNA为模板，用六碱基随机引物（randomhexamers）合成cDNA一链，并加入缓冲液、dNTPs、RNaseH和DNApolymeraseI合成cDNA二链，经过QiaQuickPCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱经末端修复、加polyA，加测序接头，再经琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段，并

8、进行PCR扩增，从而完成