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《分子生物学研究质粒抽提》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、实验一质粒DNA提取一、原理在碱性溶液中，细菌的线性大分子量染色体双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构破坏而发生变性；而质粒DNA由于分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，在高碱性条件下，虽然变性但仍处于拓朴缠绕状态,两条互补链不会充分分离，当加入中和缓冲液时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型；而线性的分子量较大的细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白SDS等形成不溶性复合物，可通过离心沉淀被去除。而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中，残留的RNA可用RNA酶去除。残留的蛋白质可用酚/氯仿去除,进而得到纯化的质粒DNA。二、材料与试
2、剂含pET28-gene的E.coliDH5α菌液（用试剂盒抽提）（用溶液IIIIII抽提）质粒抽提主要溶液：溶液Ⅰ(P1)：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)。溶液Ⅱ(P2)：0.2mol/LNaOH，1％SDS。溶液Ⅲ(P3)：5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml,至100ml。１：试剂中所用葡萄糖有增加粘度，降低剪切率，减少DNA的降解；２：试剂中所用EDTA有抑制DNase的作用，还能降低离子浓度；3：SDS能使蛋白变性并形成不溶性复合
3、物；4：试剂中所用NaOH能使DNA变性，KAc-冰醋酸能使DNA复性，并有助于蛋白等其它大分子成分沉淀。一、步骤及原理从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：(1)培养细菌使质粒扩增；(2)收集和裂解细胞;(3)分离和纯化质粒DNA。三、操作步骤(一)细菌的培养和收集将含有pET28-gene的DH5α菌种接种在LB固体培养基中,37℃培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到50mlLB液体培养基(含Kan)中,37℃振荡培养约12小时至对数生长后期。（二）碱法抽提质粒DNA1、取1.4ml培养菌液至1.5ml离心管中,10000
4、rpm离心2min。弃上清,再吸取1.4ml培养菌液于同一离心管，10000rpm离心2min将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽.2、菌体沉淀重悬浮于150μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),3、加入新配制的溶液Ⅱ200μl,盖紧管口，温和颠倒离心管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),室温放置2-5分钟。4、加入180μl预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒,使沉淀混匀,-20℃放置5分钟,10000rpm离心10分钟。5、上清液移入干净离心管中,加入等体积的氯仿,振荡混匀,10000rpm离心5分钟。6、将水相移入干净离心管中,加入2
5、倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000rpm离心10分钟。7、弃上清,将管口敞开倒置于纸巾上使所有液体流出,加入1ml70％乙醇洗沉淀,4℃下12000g离心5分钟。8、吸除上清液,将管倒置于纸巾上使液体流尽,室温干燥。9、将沉淀溶于30μlTE缓冲液(pH8.0，含20μg/mlRNaseA)中，37℃放置1h,然后储于-20℃冰箱中。（二）TIANprepMiniPlasmidKit抽提质粒DNA1、柱平衡：向吸附柱CP3加入500ul平衡液BL，10000g离心1min。2、取1.4ml培养菌液至1.5
6、ml离心管中,10000g离心2min，弃上清（重复一次）,将管倒置于纸巾上数分钟,使液体流尽。3、菌体沉淀重悬浮于250μl溶液P1中,振荡使彻底悬浮。4、加入250μl溶液P2,温和颠倒离心管6-8次,混匀内容物。5、加入350μl溶液P3,温和颠倒离心管6-8次,使沉淀混匀,10000g离心10min。6、将上清液转移至吸附柱CP3中（不要吸沉淀）,10000g离心1min,弃收集管中的废液。7、向吸附柱CP3加入700ul漂洗液PW,10000g离心1min,弃废液；再次加入500ul漂洗液PW,10000g离心1min,弃废液。再次离心
7、2min。8、将吸附柱CP3置于干净离心管,向膜中央加入30ul洗脱液EB,室温放置1-2min。10000g离心2min,然后储于-20℃冰箱中。核酸定量紫外吸收法比尔-朗伯定律：ODλ=єc双链DNA：1OD260＝50ug/mL单链DNA和RNA：1OD260＝40ug/mL单链寡核苷酸：1OD260＝33ug/mL双链DNA浓度C(mg/mL)=50ug/mLXOD260nmX稀释倍数优点：快速，不破坏样品缺点：灵敏度低，要求样品较纯OD260／OD280：用于表示蛋白制品被核酸污染的程度，也可用来表示核酸被蛋白污染的程度，但核酸的消光系
8、数较高，只有存在较多的蛋白污染时才能反应出来。纯DNA：OD260:OD280=1.8-1.9如果大于此值，说明有蛋白污染；如果小于此值
