生产中常用菌种的分离、选育和保藏1

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1、第二章发酵工业常用微生物及培养第二章发酵工业常用微生物及培养２.１菌种的分离２.２　菌种选育２.３　菌种保藏及防止衰退的措施２.４　培养基的配制２.５　菌种的扩大培养２.6微生物的几种接种方法带图象分析系统的微生物菌种显微观察装置2.1菌种的分离一、发酵工业常用微生物的要求二、菌种的来源三、新种分离与筛选的步骤四、自然界中细菌的分离生产菌不是病原菌及其产物无毒性原料来源广、廉价，菌种大量高效地合成产物菌种纯，遗传性能稳定，不易感染噬菌体生长繁殖能力强，发酵周期短发酵中少产与产品相近的副产品一、发酵工业常用微生物的要求二、菌种的来源根据资料直接向有科研单位、高

2、等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种。定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。采样：有针对性地采集样品。增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。分离：利用分离技术得到纯种。发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。三、新种分离与筛选的步骤（一）采样1.采样对象：以采集土壤为主，也可以是植物，腐败物品，某些水域等。2.采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。3

3、.采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。从自然界筛选（二）增殖培养为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物在数量上不要增加，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。例如碳源利用的控制，可选糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。（三）分离筛选尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。

4、因此还必须分离，纯化。在这—步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。（四）发酵性能测定生产性能：发酵周期、产品品种和产量等安全性能：自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。四、自然界中细菌的

5、分离采样的注意事项采样时应尽可能保持相对无菌；所采集的样本必须具有某种代表性；采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理等；应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的；采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4℃下，但贮存时间不宜过长。采样和采集方法为了从一特定生态系统中分离出具有代表性的细菌菌群，特别是分离那些在唯一微环境区域中出现的菌群时，必须十分重视样本的采集。样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样采集器、镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。1．土样采集方法森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下

6、层向上层顺序采集；水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆筒采集，可取离地面5～15cm处的土。将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。在采集植物根际土样时，一般方法是自土壤中慢慢拔出植物根，在大量无菌水中浸渍约20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下根部残留的土，这部分上却为根际土样。2．水样采集方法用于细菌检测的水样应收集于100m1干净、灭菌的广口塑料瓶中。由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静水层中采集水样。方法是：握住采样瓶底浸入水中30-50cm处，然后瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话，应直接将瓶口反向于急流。采

7、集瓶从水中取出时应迅速并带有较大的弧度。水样不应装满采样瓶。所有水样都应在24h之内迅速进行检测，或者4℃下贮存。２.２　菌种选育菌种的选育：是运用生物遗传和变异原理，用人工方法造成变异，经过筛选，得到使现存的优良性状强化，或去除不良性质或增加新的性状的工业菌种的过程。1.自然选育2.诱变育种3.其他育种菌种的选育方法：1.自然选育定义：在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自然突变进行菌种筛选的过程。突变因素：1.多因素低剂量的诱变效应2.碱基配错效应以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-6——10-10左右。2

8、诱变育种诱变育种：以诱发突变为基础的育