水稻品种DNA指纹检测及其应用

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1、水稻品种SSR指纹图谱及其应用实验目的学习SSR指纹图谱的构建原理与方法应用SSR指纹图谱进行水稻品种的鉴别实验原理1、生物具有丰富的遗传多样性，并在个体形态上表现出千姿百态。2、DNA分子标记技术的发展，使得在DNA分子水平揭示生物的遗传多样性成为可能。（稳定性好、不受环境和发育时期限制等多方面优越性）3、DNA指纹图谱（条码技术）能有效鉴别不同生物物种或同一物种的不同基因型。4、常用的几种DNA分子标记：1）RFLP2）AFLP3）RAPD4）SSR5）SCAR：sequencecharacterizedamplifiedregion6）CAPS：cleave

2、damplifiedpolymorphicsequence7）InDelSSR分子标记的原理：SSR序列特征：如：————(AG)n————(AG)n,n=36(AG)n,n=112(AG)n,n=75SSR的PCR扩增及电泳检测一般为共显性，在F2群体中，理论上[A]：[AB]：[B]=1：2：1ABABBABA…………标记等位基因的识别与标识RM267多态性RM522单态性标记RM552多态性ABCABDC表1不同基因型SSR指纹图谱示例标记基因型M1M2M3M4M5M6M7M8M9…P1ABBABCABFP2CBAADDBACP3BBADCFEBAP4EBA

3、DCBBAB影响指纹图谱特异性的主要因素：1、生物内在的遗传多样性2、标记的多态性3、标记的数目应用SSR指纹图谱鉴定杂交稻真假杂种的实例Ref：彭锁堂、庄杰云、颜启传、郑康乐.我国主要杂交水稻组合及其亲本SSR标记和纯度鉴定.中国水稻科学,2003,17(1):1～5SSR标记RM17对杂交稻“两优培九”100粒单种子的扩增结果(M分子量Marker，A不育系，R恢复系，2轮点样）实验材料1、2个杂交稻品种及其4个亲本品种1）红莲优6号（粤泰A/扬稻6号）2）两优培九（培矮64S/93-11）3）P14）P25）P36）P42、6个SSR标记（见右表）3、分组：

4、1）4人一组，用2个标记分别对6个水稻品种进行PCR扩增2）每3个小组的实验结果整合到一起，用于实验报告的撰写Chr.标记标记编号Chr.1RM212标记1Chr.2RM263标记2Chr.7RM505标记3Chr.2RM525标记4Chr.7RM234标记5Chr.2RM202标记6实验方法反应因子单个反应体积（µl）9个反应用量（µl）1、ddH2O10.090.02、10×buff2.018.03、25mMMgCl21.816.24、10mMdNTPs1.09.05、5uMprimer2.018.06、5U/ulTaq酶0.21.8(分装前先离心)7、DNA

5、模板3.01、PCR反应体系配制：在0.5ml离心管中配制反应混合液1)先按9个反应所需量配制因子1-6的混合液，瞬时离心混匀2)将混合液分装到6个反应管中，每管17µl3)向每管分别添加6个水稻品种的DNA模板，4)再向每管各加1小滴矿物油，瞬时离心5)按标记（每标记1列）将反应管安放到PCR仪上每个标记分别在1个0.5ml离心管中配制反应混合液①94℃预变性5min②94℃变性1min③55℃退火1min④72℃延伸1min⑤重复步骤②-④35次⑥72℃延伸10min注：退火温度对扩增产物的影响？2、PCR扩增程序1）制胶：用1×TAE液配制4%琼脂糖凝胶70

6、ml+10ulGoldViewer2）点样：每管加入2ul溴酚兰加样缓冲液，瞬时离心。取10ul扩增产物点样(请注意点样顺序)3）电泳：稳压（100V），电泳1.5h4）观察：紫外灯下观察电泳结果3、琼脂糖凝胶电泳多态性标记的筛选4、实验结果分析6个多态性标记构建的水稻品种SSR指纹图谱请利用不同品种的SSR指纹图谱判断P5、P6杂交种的亲本来源特别提示实验报告务必有图片PCR试剂准备1、每3个小组（12人）共用1套试剂（实际反应数36个）（PCR试剂各提供72个反应需用量，6对引物各提供12个反应需用量）2、4个班合计173人，共提供16套PCR试剂3、每套PC

7、R试剂提供量（见下表）PCR试剂72个反应需用量每套试剂实际提供量1、ddH2O10*72=720ul1500ul2、10×buffer2.0*72=144ul180ul3、25mMMgCl21.8*72=130ul150ul4、10mMdNTPs1.0*72=72ul100ul5、10uMprimer2.0*12*6=24ul*630ul*6(每对正反引物混合)6、5U/ulTaq酶0.2*72=14.4ul25ul