核酸的物理化学性质

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1、第15章核酸物理化学性质NucleicAcid一、核酸的水解核酸可被水解的位点有磷酸酯键和糖苷键，其中糖苷键更易被水解。5′端3′端CGA核酸的酸水解嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳定，对酸最不稳定的是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键。DNA在pH1.6于37℃对水透析可完全除去嘌呤碱；在pH2.8于100℃加热1h，也可完全除去嘌呤碱。核酸的碱水解RNA的磷酸酯键易被碱水解，产生核苷酸。DNA的磷酸酯键则不易被碱水解。这是因为RNA的核糖上有2’－OH，在碱作用下形成磷酸三酯。磷酸三酯极不稳定，随即水解，产生核苷2’，3’－环磷酸酯。该

2、环磷酸酯继续水解产生2’－核苷酸和3’－核苷酸。DNA一般对碱稳定，若在1mol/LNaOH中加热至100℃4h，可以得到小分子的寡聚脱氧核苷酸。核酸的酶水解水解核酸的酶种类很多。非特异性水解磷酸二酯键的酶为磷酸二酯酶，如蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶。专一水解核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶。另外还有非特异水解糖苷键的糖苷酶。核酸酶的分类Ⅰ按底物专一性分类：作用于RNA的称为RNA酶（ribonuclease，RNase）；作用于DNA的称为DNA酶（deoxyribonuclease，DNase）。按对底物作用的方式可分为核酸内切酶（endo

3、nuclease）和核酸外切酶（exonuclease）。少数核酸酶既可内切又可外切。核酸酶的分类Ⅱ核酸外切酶有5’→3’方向切割的，也有3’→5’方向切割的，分别称为5’→3’外切酶和3’→5’外切酶。还有对特定核苷酸序列部位进行切割的。如:限制性核酸内切酶二、核酸的酸碱性质具有芳香环结构特点能发生酮式/烯醇式、氨式/亚氨式互变嘌呤和嘧啶碱基都具有弱碱性______主要是环内氨基的贡献1、碱基的解离胞嘧啶中尿嘧啶及胸腺嘧啶中鸟嘌呤和次黄嘌呤中质子则结合到N7上2、核苷的解离戊糖可增强碱基的酸性解离核糖中的羟基也可发生解离3.核苷酸的解离磷

4、酸基使核苷酸具有很强的酸性DNA等电点为4～4.5；RNA等电点为2～2.5三、核酸的紫外吸收碱基含有共轭双键最大吸收峰260nm左右核酸溶液紫外吸收以摩尔磷的吸光度表示，摩尔磷即相当于摩尔核苷酸。ε：摩尔吸光系数A：吸收值W：每升溶液磷重量L：比色杯内径OD260的应用：1.DNA或RNA的定量OD260=1.0相当于50μg/ml双链DNA40μg/ml单链DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度DNA纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品:OD260/OD280=2.0含杂蛋白及苯酚，降低3.判断DNA是

5、否变性四、核酸的变性、复性与杂交(一)核酸的变性（denaturation）1、DNA的变性：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。某些理化因素破坏了氢键和碱基堆积力，使核酸分子高级结构改变、理化性质及生物活性发生改变。不涉及磷酸二酯键断裂，一级结构不变2、变性的实质降解：核苷酸骨架上3’，5’-磷酸二酯键的断裂DNA变性的本质是双链间氢键的断裂高温（一般＞75℃）—热变性强酸、碱—酸碱变性甲醛（Agarose中RNA）尿素（PAGE中DNA）3、变性因素OD260增高粘度下降比旋度下降浮力密度升高酸碱滴定曲线改变生物活性丧

6、失4、变性后理化性质变化RNA变性：从螺旋到线团之间的转变RNA的变性引起的性质变化没有DNA明显完全变性后核酸紫外吸收值增加：天然DNA25－40%、RNA约1.1%实质：碱基暴露由于变性或降解引起紫外吸收增加的现象称增色效应DNA变性5、DNA热变性的特征变性过程是“跃变式”的，而非渐变解链曲线：连续加热DNA，以温度对A260作图，所得的曲线称为解链曲线。指增色效应达50%时的温度一般DNATm值在85-90C之间Tm：DNA变性时，OD260达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度或融解温度(Tm)。大小与G+C含量成正比。

7、（1）DNA的均一性：（2）G－C含量：经验公式：XG+C＝（Tm－69.3）×2.44（3）介质中的离子强度：Tm值大小与下列因素有关：(二)核酸的复性（renaturation）变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的单链重新缔合成双链——复性。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing)。DNA复性分子量越大复性越难；浓度越大，复性越容易；DNA复性也与它本身组成和结构有关（具有很多重复序列DNA，复性快）。减色效应（低色效应）——复性时紫外吸收减少的现象(三)核酸的杂交DNA-DNA杂交双链分子变性复性

8、不同来源的DNA分子Southern杂交Northern杂交Western杂交