核酸的物理化学性质和常用的研究方法

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1、第十九章核酸的物理化学性质和常用的研究方法1核酸的物理化学性质天然DNA分子细丝状的双螺旋结构赋予DNA一系列显著的物化特性：极大的粘度；易于断裂；易形成纤维状物质；在稀盐溶液中热变性；熔点高RNA分子没有如此明显的物化特性2一、核酸的紫外吸收1、核酸具有紫外吸收吸收范围：240-290nmλmax=260nm（定量测定）2、根据紫外吸收判断样品纯度不纯的样品DNA：A/A=1.8；RNA：A/A=2.0260280260280纯的核酸分子或寡核苷酸A=150μg/ml双螺旋DNA40μg/ml单链DNA(或RNA)20μg/ml寡核苷酸3一、核酸的紫外吸收3、用摩尔磷消光系数ε(

2、p)表示溶液中核酸的含量碱基和磷原子含量相等，可以用P的含量来表示核酸的含量ε(p)=A/CL=30.98A/WLA：光吸收值C：磷的摩尔浓度L：比色杯内径W：每升溶液中磷的重量（g）4一、核酸的紫外吸收DNA的ε(P)：6600RNA的ε(P)：7700-7800核酸的ε(P)比核苷酸单体低单链多核苷酸的ε(P)比双螺旋多核苷酸的ε(P)要高增色效应：核酸变性时，ε(P)增加减色效应：当核酸复性时，ε(P)降低5二、核酸的沉降特性溶液中的核酸受到引力作用会下沉，不同构象的分子沉降速度有很大差异超速离心：分离纯化核酸测定核酸的沉降系数相对分子量6二、核酸的沉降特性密度梯度超离心分离

3、RNA常用蔗糖梯度，分离DNA常用CsCl梯度实验室纯化质粒DNA：染料（溴乙锭）-CsCl密度梯度超离心，得到的DNA纯度较高，可用于DNA重组，测序及限制酶图谱等DNA的密度与G-C含量成正比7三、核酸的变性、复性及杂交（一）、变性（denaturation）1.变性和降解稀盐溶液DNA的变性过程是双螺旋结构被破坏，物化性质发生改变的过程8变性实质：氢键断裂，双链解体成单链核酸的降解：多核苷酸骨架上共价键断裂，因而引起核酸分子量的降低氢键的破坏导致变性，共价键的破坏导致降解9三、核酸的变性、复性及杂交4.DNA的熔解温度Tm(meltingtemperature)DNA变性的特

4、点：爆发式DNA的熔点Tm通过加热使DNA的双螺旋结构解旋50％时的温度DNA的Tm：82–95℃S形曲线－DNA的变性曲线10三、核酸的变性、复性及杂交影响Tm值的因素ⅰ）DNA的均一性ⅱ）G-C含量ⅲ）介质的离子强度低离子强度：Tm下降，熔解温度范围宽高离子强度：Tm较高，熔解温度范围窄11三、核酸的变性、复性及杂交5、RNA的变性特点：Tm较低，变性曲线较宽tRNA的Tm较高双链RNA的变性与DNA相同12（二）、复性（renaturation）复性：在适当条件下，变性DNA的两条链重新缔合成双螺旋结构的过程复性：物化性质和生物活性DNA复性的影响因素1、降温速度退火：变性D

5、NA缓慢冷却而复性的过程2、DNA片段的大小3、DNA的浓度4、核苷酸顺序的复杂程度13三、核酸的变性、复性及杂交（三）、核酸的杂交（hybridization）将异源DNA在同一体系中同时变性，如果异源DNA彼此间有部分序列相同，它们在复性时会形成杂交分子DNA－DNA，DNA－RNA介质：液相，固相（硝酸纤维素膜）14SouthernBlottingE.M.Southern（1975）DNA→酶解→电泳→变性↓洗涤←杂交←烘烤←转移↓放射自显影15四、核酸的酸碱性质1、酸碱性质核酸具有较强的酸性核酸可视为多元酸碱基碱基氢键溶液pH稳定性解离状态溶液的pH直接影响着双螺旋结构的稳

6、定核酸是两性电解质，在不同pH溶液中的解离程度不同。两性解离导致兼性离子的形成，所以核酸也有等电点16四、核酸的酸碱性质2、核酸的水解酸水解糖苷键和磷酸二酯键都可以被酸水解：糖苷键，嘌呤碱基的糖苷键，脱氧核糖，脱氧核糖与嘌呤碱基形成的糖苷键最不稳定，易于得到无嘌呤酸碱水解RNA在碱性条件下会产生2’-核苷酸和3’-核苷酸17酶水解磷酸二酯酶：非特异性水解磷酸二酯键的酶核酸酶：特异性水解核酸的磷酸二酯酶叫核糖核酸酶，脱氧核糖核酸酶，核酸内切酶，核酸外切酶（如3’-或5’-核苷酸酶）非特异性的磷酸单酯酶对一切核苷酸都能作用18五、核酸的分离与纯化3、凝胶电泳简单，快速，分离效果好，大小

7、分子都适用凝胶电泳对核酸的分离作用主要依赖于它们的分子量及分子构型，而凝胶的类型及其浓度对被分离核酸的分子大小关系重大19五、核酸的分离与纯化琼脂糖凝胶电泳(agarosegelelectrophoresis)琼脂糖浓度：2.5－0.1%分离片段大小：5×104－5×108D琼脂糖凝胶用于分析DNA较好，分析RNA时易降解，必须加入蛋白质变性剂聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）胶的浓度：24－2.4%分离片段大小：3.3×102－1×106DPAGE可分析小于1000bp