生物化学第14章核酸的物理化学性质和第15章核酸的研究方法

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1、第14章核酸的物理化学性质(Physicalandchemicalpropertiesofnucleicacid)一、核酸的水解二、核酸的酸碱性质三、核酸的紫外吸收四、核酸的变性、复性及杂交一、核酸的水解核酸可被水解的位点有磷酸酯键和糖苷键，其中糖苷键更易被水解。核酸的酸水解嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳定，对酸最不稳定的是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键。DNA在pH1.6于37℃对水透析可完全除去嘌呤碱；在pH2.8于100℃加热1h，也可完全除去嘌呤碱。为了水解嘧啶糖苷键，需要较高的温度。用

2、甲酸（98%～100%）密封加热至175℃2h，无论RNA或DNA都可以完全水解，产生嘌呤碱和嘧啶碱，缺点是尿嘧啶的回收率较低。改用三氟乙酸在155℃加热60min（对DNA）或80min（对RNA），嘧啶碱的回收率显著提高。核酸的碱水解RNA的磷酸酯键易被碱水解，产生核苷酸。DNA的磷酸酯键则不易被碱水解。这是因为RNA的核糖上有2’－OH，在碱作用下形成磷酸三酯。磷酸三酯极不稳定，随即水解，产生核苷2’，3’－环磷酸酯。该环磷酸酯继续水解产生2’－核苷酸和3’－核苷酸。DNA一般对碱稳定，若在1m

3、ol/LNaOH中加热至100℃4h，可以得到小分子的寡聚脱氧核苷酸。RNA的碱水解核酸的酶水解水解核酸的酶种类很多。非特异性水解磷酸二酯键的酶为磷酸二酯酶，如蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶。专一水解核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶。另外还有非特异水解糖苷键的糖苷酶。核酸酶的分类Ⅰ按底物专一性分类：作用于RNA的称为RNA酶（ribonuclease，RNase）；作用于DNA的称为DNA酶（deoxyribonuclease，DNase）。按对底物作用的方式可分为核酸内切酶（endonuclease）和核

4、酸外切酶（exonuclease）。少数核酸酶既可内切又可外切。核酸酶的分类Ⅱ按磷酸二酯键断裂的方式可将核酸酶分为两类，一类断裂磷酸二酯键后磷酸保留在5’位，一类磷酸保留在3’位。作用于双链的为双链酶，作用于单链的为单链酶。核酸外切酶有5’→3’方向切割的，也有3’→5’方向切割的，分别称为5’→3’外切酶和3’→5’外切酶。还有对特定核苷酸序列部位进行切割的（限制性内切酶）。二、核酸的酸碱性质碱基的解离Ⅰ胞嘧啶的解离碱基的解离Ⅱ尿嘧啶的解离胸腺嘧啶的解离碱基的解离Ⅲ腺嘌呤的解离鸟嘌呤的解离核苷的解离

5、核苷中由于戊糖的存在，碱基的解离常数有所下降，说明糖的存在增强了碱基上可解离基团的酸性。核苷酸的解离核酸中磷酸基的解离核苷酸的解离曲线Ⅰ核苷酸的解离曲线Ⅱ尿苷酸的碱基的碱性极弱，实际上测不出其含氮环的解离曲线，故不能形成兼性离子。小牛胸腺DNA的滴定曲线从中间往两边滴为曲线Ⅰ，非缓冲区较宽。从两边往中间滴为曲线Ⅱ，非缓冲区较窄。这种情况是DNA双链分子解链导致的三、核酸的紫外吸收嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸、核酸在240～290nm有强烈的吸收，最大吸收值在260nm附近。紫外吸收

6、是实验室中最常用的定量测定DNA或RNA浓度的方法。对于纯的样品，只要测出260nm的A值即可计算出浓度。通常A值为1相当于50μg/ml双链DNA，或40μg/ml单链DNA或RNA。测定紫外吸收值还可以鉴定核酸溶液的纯度。纯DNA的A260/A280应大于1.8，纯RNA应达到2.0。若低于此值说明含有杂质。四种核苷酸的紫外吸收曲线摩尔磷吸光系数有时核酸溶液的紫外吸收以摩尔磷的吸光度来表示。摩尔磷即相当于摩尔核苷酸。先测定核酸溶液中的磷含量及紫外吸收值，然后求出摩尔磷吸光系数。式中A为测得的吸光度

7、，c为磷的浓度，L为比色杯的厚度，W为每升溶液中磷的重量（克）。DNA的增色效应和减色效应一般天然DNA的ε(P)为～6600，RNA为7700～7800。单链核酸的ε(P)比双链核酸的大，核苷酸单体的ε(P)更大。双链DNA变性成单链后ε(P)值增大，称为增色效应；复性后ε(P)值减小，称为减色效应。这是因为双链结构使碱基对的π电子云发生重叠，减少了对紫外光的吸收。DNA的紫外吸收光谱1.天然DNA2.变性DNA3.核苷酸总吸光度值四、核酸的变性、复性及杂交核酸的变性核酸的变性就是双链之间的氢键断裂

8、，成为单链。变性主要是双链DNA变成单链，也可以是单链RNA分子内的局部双链变成单链。使核酸变性的因素有高温、过酸过碱、变性剂等。常用的核酸变性剂有尿素、甲醛。DNA变性示意图DNA分子的熔点Tm在DNA分子的热变性中，随着温度的升高，当温度达到一定值后，双链开始解开，然后有一个迅速的解链，成为无规线团，变性的温度区间很窄，我们把双链DNA解开一半时所需的温度称为该DNA的熔点（Tm）。DNA的Tm一般在82～95℃之间。DNA分子的热变性曲线DNA分子