《链内切核酸酶》PPT课件

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1、第六节单链内切核酸酶小组成员：耿沙沙赵彦朵朱新娅王高伟基因工程2021/7/241本节重点：1.S1核酸酶的活性和应用。2.Bal31核酸酶的活性和应用。3.脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ)的活性和应用。2021/7/242一、S1核酸酶S1核酸酶来源于米曲霉菌，是一种含锌的蛋白质，相对分子质量为32000，相对耐热，由nucO编码，该基因已被克隆。S1核酸酶是一种高度单链特异性的内切核酸酶，催化反应需要Zn2+和酸性条件，最佳pH4.0~4.5。2021/7/243S1核酸酶的特性：（1）在高离子强度、pH4.2和1m

2、mol/LZn2+存在的条件下，S1核酸酶可以高特异性地降解单链DNA和RNA，包括双链分子中的单链区域（如发卡结构），反应产物为5'单核苷酸。2021/7/244（2）调节S1核酸酶的用量，可以切割双链DNA的单链缺刻，但不能识别单个碱基对的错配。（3）当S1核酸酶用量过大时，伴有双链核酸的降解，但该酶降解单链DNA的速度是降解双链DNA的75000倍。2021/7/2452021/7/246S1核酸酶的应用：（1）可用于切掉DNA片段的单链突出末端以产生平末端；（2）打开双链cDNA合成中的发夹环结构；（3）S1核酸

3、酶作图法在测定杂交核酸分子的杂交程度、RNA分子定位、确定内含子的位置、内含子和外显子剪切位点的定位、转录起始位点与终止位点的测定中，S1核酸酶都是十分有效的工具。2021/7/247S1核酸酶的活性可被PO43-、5'核苷、核苷三磷酸、枸橼酸盐和EDTA抑制。然而，其在低溶度的变性剂（如SDS、尿素甲酰胺）存在的条件下稳定。2021/7/248二、Bal31核酸酶Bal31核酸酶的特性：对单链DNA具有特异的内切酶活性，可从3'-OH末端迅速降解DNA。对于线性双链DNA分子，它表现为3'→5'端的外切酶活性和5'

4、→3'的外切酶活性，可有控制地从3'末端和5'末端逐个水解除去单核苷酸，产生缩短了的DNA分子。（注意：Bal31的3'外切酶活性约为它的单链特异性内切酶活性的20倍）2021/7/249当底物是双链环形的DNA分子时，Bal31的单链特异性内切核酸酶活性，通过对单链缺口或瞬时单链区的降解作用，将超螺旋的DNA切割成开环结构，进而成为线性双链DNA分子。除此以外，Bal31核酸酶还可起到核糖核酸酶的作用，催化核糖体和tRNA的降解，但它不具有双链特异的核酸外切酶活性。2021/7/24102021/7/2411Bal

5、31核酸酶的应用：Bal31核酸酶降解DNA需要Ca2+的存在，在反应的不同阶段加入螯合剂—EGTA（乙二醇双β－氨基乙醚四乙酸）可使反应终止。（1）用于确定DNA片段的限制酶图谱使用Bal31核酸酶降解待测DNA，在不同反应时间取出反应物，用EGTA溶液中止反应。然后，各样品用相应限制性内切核酸酶消化后，可看到酶切片段按一定的顺序消失。2021/7/2412限制酶图谱就是一系列限制酶的特异识别序列在DNA链上的出现频率和它们之间的相对位置。它实际上就是限制酶的特异切点在DNA上的定位，表现出一些部位的线性序列，它是DN

6、A分子结构特异性的反映，所以限制酶图谱又称DNA的物理图谱。2021/7/2413（2）可用于在克隆前通过可控方式去除双链DNA末端不需要的序列。处理后的DNA末端，可用T4噬菌体DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段补平，再加入合成接头，插入适当载体。用此方法，还可以在DNA上生成一系列终点确定的缺失突变体。（3）用于确定DNA分子的二级结构2021/7/24142021/7/2415三、脱氧核糖核酸酶Ⅰ脱氧核糖核酸酶Ⅰ简称DNA酶Ⅰ（DNaseⅠ），是来源于牛胰脏的糖蛋白。它是一种需要二价阳离子的内切核

7、酸酶，能从嘧啶核苷酸5'端磷酸基处随机降解单链或双链DNA，生成具有5'磷酸末端的寡核苷酸。当有Mg2+存在时，能在双链DNA上随机独立地产生切口；而在Mn2+存在时，则在双链DNA的大致同一位置上切割，产生平末端DNA片段。2021/7/2416脱氧核糖核酸酶Ⅰ的应用：在分子克隆中，DNA酶Ⅰ主要用于：与大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ联合参与切口平移法标记DNA分子；在Mn2+存在下，随机裂解双链DNA分子，构建大片段插入的基因文库；用于DNaseⅠ足迹法分析DNA结合蛋白在DNA上的精确结合位点；使用无RNase的D

8、NaseⅠ去除转录产物中的模板DNA。2021/7/2417谢谢2021/7/2418