《让质粒鲜活起来》PPT课件

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1、让质粒鲜活起来生物技术102班第二小组成员：华璐、钟依依、苗舒、庄思静、章辉辉质粒的概念质粒是一类亚细胞有机体，结构比病毒还要简单，既没有蛋白质外壳，也没有细胞外的生命周期，却能在宿主细胞中独立地增值，并随着宿主细胞的分裂而被遗传下去。Plasmid目录CONTENTS基本性质主要类型提取方法异同分析质粒的基本性质质粒分子的构型多样、大小不一1质粒的自主复制性和可扩增性2质粒的可转移性3质粒的不相容性4质粒分子的构型多样、大小不一共价封闭环状DNA，即SC构型。开环DNA，称作OC构型。线形DNA，即L构型123除了酵母的杀伤质粒是一种RNA质粒外，目前发现的

2、质粒都是以DNA方式存在的。质粒的自主复制性和可扩增性根据质粒复制与宿主菌相关程度不同，可将质粒分为严谨型质粒和松弛型质粒（常被选为基因工程载体）严谨型质粒通常是一些具有自身传递能力的大质粒，其复制与宿主菌密切相关。松弛型质粒通常是分子量较小，不具传递能力的质粒，它在宿主菌内通常可含10-200个拷贝，且不受宿主菌蛋白合成的影响。质粒的可转移性质粒的可转移性是指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。根据是否携带控制细菌配对和质粒接合转移的基因，质粒可分为接合型质粒和非接合型质粒两类。质粒的不相容性质粒的不相容性有时也称质粒的不亲和性，它是指在没有选择压力的情况

3、下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一个宿主细胞系中稳定共存的现象，这样的两种质粒称为不亲和质粒。No.1主要依赖天然存在的质粒No.2人工构建一批分子量相对较小、拷贝数较多、具特殊功能的质粒载体No.3主要借助于一些辅助序列引入新的功能质粒研制与发展的三个阶段常用的几种质粒pBR322质粒载体这是目前常规基因克隆实验中最普遍采用的载体，有万能质粒之称。pUC质粒载体它实际上是由pBR322质粒载体改造而来的一系列质粒载体的总称。它包括有pUC8、pUC9、pUC12、pUC13、pUC18等。PvuⅡ2067pBR322质粒载体结构图pUC18质粒载体结

4、构图pUC系列质粒载体的优点与pBR322质粒载体相比，pUC系列质粒载体具有许多优越性：（1）具有更小的分子量和更高拷贝数。（2）由于具有来自大肠杆菌lac操纵子lacZ’的基因，它所编码的α肽链可参与α互补作用，可用于组织化学方法检测重组体。（3）具有多克隆位点MCS区段。质粒的提取在提出的许多用于从细菌中提纯质粒DNA的方法中都含有以下3个步骤:（1）细菌培养物的生长。（2）细菌的收获和裂解（3）质粒DNA的纯化。提取的方法质粒DNA的提取方法主要有：碱裂解法（此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析）煮

5、沸法酚氯仿裂解法。碱裂解法1.接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2mlLB培养基。2.37℃振荡培养过夜。3.取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。4.加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/LEDTApH8.0，25mM/LTris-HClpH8.0)充分混合。5.加入0.2ml溶液II(0.2mM/LNaOH，1％SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5min。6.加入0.15m1预冷溶液III(5mol/LKAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5min。7.以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8.加入等体积的

6、异戊醇，混匀后于0℃静置10min。9.再以10，000rpm离心20min，弃上清。10.用70％乙醇0.5ml洗涤一次，抽干所有液体。11.待沉淀干燥后，溶于0.05mlTE缓冲液中相关试剂的作用（一）溶液I，50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA，pH8.0主要作用是：调节反应液pH，使大肠杆菌悬浮于反应液中，螯合Ca2+、Mg2+等二价金属离子。（二）溶液II，0.2NNaOH/1%SDS主要作用是：两者共同作用，使细胞溶解（其中NaOH为主，SDS为辅）。（三）溶液III，3M醋酸钾/2M醋酸主要作用是：使钾离子置换SDS中的钠离子

7、而形成不溶性的PDS，同时高浓度的盐，使得沉淀更加完全。（四）异戊醇主要作用是：为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。（五）乙醇主要作用是：进一步沉淀质粒DNA，去除残留的盐。质粒提取基因组提取提取步骤基本上都属DNA的提取步骤，包括细胞裂解，DNA释放，纯化，最后沉淀溶解提取中有一个DNA变性、复性的过程，整个过程较为简单，用时短。没有DNA变性、复性的过程，对有些革兰氏阳性菌要进行溶菌酶处理，整个过程更复杂，耗时更长。与基因组提取的异同Thankyou!