微生物的利用-微生物的选择培养和计数

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1、微生物的应用——土壤中微生物的分离与计数实验设计一实验目的：（1）从土壤中能分离出能够分解尿素的细菌（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌实验原理：（1）尿素[CO（NH2）2]，可以被含有脲酶的微生物降解，降解成氨后可以被植物吸收，是重要的农田氮肥（2）尿素略呈中性，如果被分解将产生NH3，溶液略呈碱性（3）尿素高温、高压下会被降解过滤灭菌：使用0.22μm孔径过滤器尿素的灭菌可供参考的资料资料1：土壤是“微生物的天然培养基”，土壤中的微生物大约70%~90%是细菌，主要分布在距地表约3~8cm的土壤层资料2：样品稀释程

2、度直接影响平板上生长的菌落数，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30~300之间，适于计数的平板资料3：不同微生物需要不同的培养温度和时间，细菌一般在30~37℃的温度下培养1~2d；放线菌一般在25~28℃温度下培养5~7d；而霉菌一般在25~28℃的温度下培养3~4d；定期观察菌落的形态特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等，统计并记录数据以尿素为唯一氮源的固体选择培养基尿素、细菌过滤器土壤原液、装有无菌水的试管、移液器、枪头培养皿、涂布器（三角刮刀）酒精棉球、镊子酒精灯、火柴记号笔可以参考的实验用具

3、可供使用的实验技术1.培养基的制备技术2.无菌操作技术3.接种技术4.培养技术5.微生物的数量统计技术（计数）：在统计菌落数目时，常用来统计样品中活菌数目的方法是稀释涂布平板法。除此之外，显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法。稀释涂布计数法采用稀释涂布平板法统计菌落数目时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是（平均菌落数÷涂布的稀释液体积）

4、×稀释倍数。利用稀释涂布平板法成功统计菌落数目的关键是恰当的稀释度。显微直接计数法又称为血球计数板直接计数观察到的红细胞平均数∶观察到的细菌平均数＝红细胞含量∶细菌含量血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网。如左图。显微直接计数法（血球计数板直接计数）每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。计数室构造如左图。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格；另一种

5、是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即16×25=400小方格，如左图。计数室血球计数板25×1616×25每一个大方格边长为lmm，则每一大方格的面积为lmm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数(即0.1mm3中的总菌数)为A/5×25×B。因为:1ml=lcm3=1000mm3，故:lml菌液中的总菌数为：A/5×25×

6、l0×l000×B可供参考的实验流程可供参考的实验流程接种培养涂布平板法鉴定采集土样制备土壤稀释液菌落计数酚红指示剂请依据实验目的、原理和可供参考的资料和实验流程进行实验设计并将方案写在学案的相应位置实验设计方案土壤微生物种类最多、数量最大的原因是什么？土壤中营养物质含量丰富，环境条件适宜等。2．9实验过程：1）取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。2）应在火焰旁称取土壤10g。将称好的土样倒入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。3）在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。4）实验时要对培养皿作好标记。注明

7、培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。5）为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当事先规划时间。结果分析和评价对分离的菌种作进一步的鉴定，还需要借助生物化学的方法。3．2在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨。氨会使培养基的碱性增强，PH升高。因此，我们可以通过检测培养基pH变化来判断该化学反应是否发生。3．3在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。设计过程中应思考的问题1.如何进行实验设计2.设计时为了避免一些无关实验因素对于实验可信度

8、的影响，我们该采取怎样的措施？3.在对菌落进行计数时，为了避免一次实验的偶然性，我们该采取怎样的方法以减少误差？设置对照实验设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对照实验是指除了被测试的条件外，其他条件都