《测序知识概述》PPT课件

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1、测序知识概述InvitrogenProprietary&Confidential2Content普通测序及测序相关基础知识普通测序生产流程介绍困难模板测序相关知识困难模板测序生产流程介绍测序简单问题解答InvitrogenProprietary&Confidential3普通测序及测序相关基础知识——基本概念什么是DNA以及DNA测序又称脱氧核糖核酸，是染色体的主要化学成分，同时也是组成基因的材料。DNA分子极为庞大(分子量一般至少在百万以上)，主要组成成分是腺嘌呤脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸和胸腺嘧啶脱氧核苷酸（简称A、T、C、G）。DNA存在于细胞核、线粒体、叶绿体中

2、，也可以以游离状态存在于某些细胞的细胞质中。大多数已知噬菌体、部分动物病毒和少数植物病毒中也含有DNA。    除了RNA(核糖核酸)和噬菌体外，DNA是所有生物的遗传物质基础。生物体亲子之间的相似性和继承性即所谓遗传信息，都贮存在DNA分子中。InvitrogenProprietary&Confidential4普通测序及测序相关基础知识——基本概念DNA的结构DNA共有四级结构一级结构：由多个4种脱氧核苷酸分子通过3’，5’—磷酸二酯键连接形成的直线型或环型多聚体。二级结构：在碱基互补配对的基础上形成的DNA双螺旋结构。三级结构：在二级结构上，DNA双螺旋结构通过折叠和扭曲所形成的

3、特定构象。如超螺旋等。四级结构：指DNA与蛋白质形成的复合物。如染色体（质）。——DNA测序就是测定DNA的一级结构InvitrogenProprietary&Confidential5普通测序及测序相关基础知识——基本概念DNA结构示意图——单核苷酸及DNA的二级结构——4种脱氧核苷酸分子通过3’，5’—磷酸二酯键连接形成的直线型或环型多聚体。InvitrogenProprietary&Confidential6普通测序及测序相关基础知识——基本概念DNA结构示意图——DNA的三级结构：双螺旋DNA进一步扭曲盘绕则形成其三级结构，超螺旋是DNA三级结构的主要形式。。InvitrogenP

4、roprietary&Confidential7普通测序及测序相关基础知识——基本概念DNA结构示意图——DNA的四级结构：DNA与蛋白质形成的复合物。如染色体（质）。InvitrogenProprietary&Confidential8普通测序及测序相关基础知识——基本概念DNA测序原理目前DNA测序的原理是Sanger双脱氧链末端终止法，简单来说，就是单引物扩增的PCR反应，但是将PCR反应体系中的dNTP换成了带有荧光标记的ddNTP和dNTP的混合物。目前最普遍的DNA测序技术是采用四色荧光分别标记四种ddNTP.一个样品的测序反应只需在同一反应体系中同时加入四种ddNTP.产物无

5、须分离即可在一个泳道中电泳.序列的读取依靠检测器对不同荧光的区分.并需要通过软件系统的分析.动画演示：http://www.bbioo.com/video/2005/43.htm目前测序需要使用的仪器A.PCR扩增仪B.3730XL全自动荧光测序仪InvitrogenProprietary&Confidential9普通测序及测序相关基础知识——测序模板的要求测序分析软件A.SequencingAnalysis5.2，用于将测序原始数据转换为峰图文件B.DNAStar,用于将测序得到的结果进行拼接C.Chromas，用于显示DNA测序峰图文件测序模板的要求PCR产物直接测序PCR已纯化产物

6、：提供切胶回收纯化后的PCR产物20ul(浓度大于50ng/μl),并请提供浓度(浓度须正确)大于3.2pmol/μl的测序引物10～20μl（具体体积视客户反应数相应增加）。未纯化PCR产物：提供至少40ulPCR扩增原液，送样前取2ul经琼脂糖胶鉴定目的片断为明亮的一条带,同时请提供浓度(浓度须正确)大于3.2pmol/μl的测序引物10～20μl（具体体积视客户反应数相应增加）。InvitrogenProprietary&Confidential10普通测序及测序相关基础知识——测序模板的要求注意事项:PCR产物直接测序成功的关键是PCR产物的纯度，所以我们提倡用胶回收PCR产物。

7、如果有几条PCR产物长度相近，用电泳胶也无法分开时，此时的PCR产物直接测序会出现双峰，这种情况建议把PCR产物克隆后测序。PCR已纯化产物请用水稀释不要用elutionbuffer。PCR产物直接测序成功的另一要因是引物。不是能做PCR反应的引物便一定能测序。测序用引物要求较高,引物的3‘端必须与模板完全配对，含有Mix碱基的引物一般不能测序(特别是3’端)。此外，测序引物长度一般为20个碱基左右，GC含量必须在50～