传染病实验间接ELISA

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1、间接ELISA检测鸭传染性浆膜炎血清抗体实验目的：掌握间接酶联免疫吸附试验（ELISA）的原理及其操作方法实验材料：1抗原、待检抗体、酶标抗体（羊抗鸭）、96孔酶标板2溶液与试剂：洗涤缓冲液（PH7.4）、ELISA封闭液、抗体稀释液、TMB显色液、终止液（2mol/LH2SO4）。实验方法：（1）包被抗原，加入100ml抗原，37゜C放置1h，4゜C过夜。（2）洗涤：加入封闭液200ul每孔，室温放置3分钟，甩出液体，拍干，再加入洗涤液，重复上述操作3次。（3）加入封闭液，100ml/孔，37゜C放置30mi

2、n，洗涤三次即重复步骤（2）。（4）加入待测血清，将血清作1：100,1:200,1：400,1:800,1:1600倍稀释，加入1-5孔，100ul/孔，第6孔加入阴性对照，100ul/孔，37゜C，30min,重复（2）步骤。（5）加入酶标抗体，100ul/孔，37゜C放置30min,重复步骤（2）。（6）加入TMD底物显色，100ul/孔，室温避光20min。（7）加入终止液（2mol/L硫酸），100ul/孔。实验结果：分析与讨论：1、间接ELISA过程包括抗原吸附在固相载体上称为包被，加入待测抗体，形

3、成抗原—待测抗体复合物，再加入相应酶标记抗体，生成抗原—待测抗体—酶标记抗体的复合物，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物。在测定时，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与血清中抗体的量呈正相关，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，有色产物的量与血清中抗体的量呈正相关，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。2、判断结果：阳性应为明显黄色，阴性应呈无色或微黄色。6号孔和12号孔是阴性对照呈微黄色，是阴性反应。1、2、3、7、8、9孔呈明显黄色，是

4、阳性反应，4、5、10、11孔呈微黄色，是阴性反应。因1、2、、3、4、5和7、8、9、10、11孔是相同的两组，加入待检血清的量比例依次为1:100、1:200、1：400、1:800、1:1600依次递减，有色产物的量与血清中的抗体的量呈正相关，所以1-5和7-11孔的颜色越来越淡。3、注意：（1）洗涤在ELISA试验中至关重要，操作中共洗涤4次。第1、2次是为了洗去杂质，第3次是为了洗去多余的待见血清，第4次洗涤是为了洗去多余的酶标抗体。若洗涤不干净会造成的后果：洗涤不干净可能会使实验结果呈假阳性。例如，

5、第3次未洗干净，未与抗原特异性反应的血清残留，而酶标抗体会与所有的待检血清反应，致使用的酶标抗体增多，酶催化的显色底物更多，造成假阳性。第4次未洗干净，也会致使残留的酶标抗体使更多的底物显色，造成假阳性。另外，在洗涤操作中，由于板凹孔容量小，孔间距近，故每次加入的洗涤液量既要达到洗涤充分又要避免相邻孔内液体互相污染，切忌剧烈震荡。（2）若不加入封闭液，会造成什么结果？若不加封闭液，未被抗原占领的反应孔会吸附更多的待见血清抗体，多余的血清抗体也会与酶标二抗结合反应，酶标二抗会与更多的底物反应，造成结果假阳性。（3

6、）如何确定ELISE中的最佳抗体浓度？将抗体按不同的比例进行稀释，将抗体与抗原进行反应，会得到一个最佳浓度，再在最佳浓度上进行稀释，在进行反应将所得结果与上次的结果对比会得到最佳浓度，依次重复上步骤可得到最佳抗体浓度。（4）使用微量加样器加样必须注意加样速度不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。若加样速度太快，无法保证加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。