《杂交水稻的扩增》PPT课件

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1、杂交水稻种子纯度的鉴定——RAPD扩增传统的种子纯度鉴定主要有田间鉴定法和实验室鉴定法。实验室鉴定种子纯度主要依据种子的物理、化学及生理特性等。但随着生物化学及分子生物学技术的迅速发展，种子纯度鉴定技术产生了质的飞跃，现代生物化学和分子生物学技术被成功地引入到种子纯度的鉴定中，如分子标记等。分子标记是指以生物大分子的多态性为基础的遗传标记。广义的分子标记包括同工酶标记和DNA标记狭义的分子标记仅指DNA标记DNA标记主要有：RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism即限制性片断长度多态性)它是由

2、于核酸序列不同而造成的DNA限制性片断之间产生等位基因差异的结果。2.RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA，随机扩增多态性DNA)。3.AFLP(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，扩增片段的长度多态性)。4.SAP(SpecificAmplifiedPolymorphism,特异性扩增长度多态性)。RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA，随机扩增多态性DNA)是1990年由美国科学家J.G.K.Williams和加利福尼亚生物研究所J.W

3、elsh领导的两个小组几乎同时发展起来的一种DNA指纹技术，它是以DNA为模板，以一个随机的寡聚核苷酸序列(10个碱基)为引物，通过PCR扩增，产生分子量大小不连续的DNA片段，通过琼脂糖凝胶电泳来检测DNA多态性一般讲,通过PCR扩增产生的不连续的几个DNA产物,往往是由于不同的遗传位点而产生,多态性的产生是由于突变或重排而造成的,这些变化可以发生在引物结合位点上,也可以位于引物结合序列之间。RAPD用用于杂交水稻种子纯度鉴定的工作原理DNA多态性是指DNA碱基顺序的差异性。这种差异性不仅存在于不同的植物之间，也存在于同一种植物的不同

4、个体之间。它们的基因组DNA限制性内切酶位点的种类和数目不同，用各自DNA为模板，以一个随机的寡聚核苷酸序列(10个碱基)为引物，通过PCR扩增，产生分子量大小不连续的DNA片段，通过琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙锭染色，在紫外检测仪下观察，即可直接看到这种差异RAPD技术操作过程：一、材料杂交水稻的DNA(50ng/ul)。二、设备PCR仪，PCR管或硅化的0.5mleppendorf管，电泳装置。三、试剂1、随机引物(10mer)(5umol/L)：购买成品。2、Taq酶：购买成品。3、10xPCR缓冲液。4、MgCl2：25mmol/

5、L。5、dNTP：每种2.5mmol/L四、操作步骤：1.在25ul反应体系中,加入模板DNA1ul(50ng)随机引物1ul(约5pmol)10xPCRBuffer2.5ulMgCl22uldNTP2ulTaq酶1单位（U）加ddH2O至25ul混匀稍离心,加一滴矿物油。2.在加热至90℃以上的PCR仪中预变性94℃2分钟,然后循环:94℃1分钟，36℃1分钟，72℃1分钟，共35轮循环。3.循环结束后,72℃10分钟，4℃保存。4.取PCR产物15ul加3ul上样缓冲液(6x)于2%琼脂糖胶上电泳,稳压50-100V（电压低带型整齐

6、，分辨率高）。5.电泳结束，观察、拍照。PCR(聚合酶链式反应)，即通过引物延伸核酸的某个区域而进行的重复双向DNA合成。PCR循环过程有三种不同的事件发生：1.模板变性（92-96℃）；2.引物退火（37-65℃）；3.热稳定DNA聚合酶进行DNA合成---延伸（72℃）。变性、退火、延伸的循环过程---PCR扩增。在第二个循环中，新链作为模板参与反应，每完成一个循环将使目的DNA扩增一倍，25-35个循环后，目的DNA将达到106倍。琼脂糖电泳、EB染色即可得到DNA指纹图谱。注意事项1、电泳时一般RAPD带有5-15条,大小0.1

7、-2.0kb。2、特异性的DNA带可以克隆作为一个新的分子标记应用。RAPD技术的优点①不使用同位素，减少了对工作人员健康的危害；②可以在物种没有任何分子生物学研究的情况下分析其DNA多态性；③对模板DNA的纯度要求不高；④技术简单，无需克隆DNA探针，无需进行分子杂交；⑤灵敏度高，可提供丰富的多态性；⑥RAPD引物没有严格的种属界限，同一套引物可以应用于任何一种生物的研究，因而具有广泛性、通用性。但是，RAPD技术较易受到各种因素的影响。无论是模板的质量和浓度，短的引物序列，PCR的循环次数，基因组DNA的复杂性，技术设备等，都有可能

8、是RAPD技术重复性差的直接原因。目前，多从以下几个方面来提高反应的稳定性：①操作规范，反应体系的组成要力求一致，尽可能地使RAPD反应标准化；②提高扩增片段的分辨率；③将RAPD标记转化为SCAR标记后再