实验八DNA的限制性内切酶酶切和鉴定

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1、实验八DNA的限制性内切酶酶切和鉴定一、实验目的掌握限制性内切酶的特性。了解限制性内切酶的用途。二、DNA限制性内切酶概述和分析限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成:一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列;另一种为独立的甲

2、基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至8个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列。GAATTCCTTAAGEcoRⅠAAGCTTTTCGAAHindⅢ5´5´5´5´质粒pUC18的物理图谱三、材料重组质粒；EcoRI酶及其酶切缓冲液:购买成品；HindⅢ酶及其酶切缓冲液:购买成品;琼脂糖(Agarose)。四、仪器移液器及吸头，水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机,恒温水浴锅,微量移液枪,微波炉或电炉,紫外透射仪。五、试剂1、5×TBE电泳缓

3、冲液：配方见第一章。　　2、6×电泳载样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v)蔗糖水溶液，贮存于4℃。　　3、溴化乙锭(EB)溶液六、操作步骤1、将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml)编号,用微量移液枪分别加入质粒DNA（5---14μl）和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl,再加入重蒸水使总体积为18μl,将管内溶液混匀后加入EcoRI和HindⅢ各1μl,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量

4、减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。2、混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保温1-3小时,使酶切反应完全。3、每管加入2μl0.1mol/LEDTA(pH8.0),混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。七、电泳检测在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，EB染色，紫外透射仪下观察或拍照。思考题：写出EcoRI和HindⅢ两种内切酶消化产物的末端序列。什么是粘性末端和平末端？限制性内切酶在基因工程中有什么作用？