实验一叶绿体色素的提取分离及理化性质

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1、叶绿体色素的提取分离及理化性质的鉴定一.实验原理1.1叶绿素：主要包括叶绿素a和b分子式:ChlaC55H72O5N4MgChlbC55H70O6N4Mg结构式:卟啉环化合物四个吡咯环与四个=CH-组成一个大环,共轭双键形成一个大π键,环中央有一个镁原子,卟啉环决定叶绿素颜色,也是吸收可见光,并以诱导共振方式传递光能的根本所在,叶醇尾是由四个异戊二烯单位组成的双萜Chla蓝绿色Chlb黄绿色脂溶性:难溶于水,仅溶于酒精、丙酮、已醚、已烷等有机溶剂卟啉环头部呈极性,具亲水性;叶醇尾部具亲脂性皂化反应:Chla、Chl

2、b是双羧酸的酯一个羧基被甲基酯化可发生皂化反应另一个羧基被叶醇基酯化COOCH3C32H30ON4Mg+2KOHCOOC20H39COOKC32H30ON4Mg+CH3OH+C20H39OHCOOK取代反应：卟啉环中的Mg2+可被H2+、Cu2+、Zn2+取代，被Cu2+、Zn2+取代后仍保持绿色光学特性：（1）吸收光谱：色素溶液随波长改变而发生光吸收变化的图谱ChlaChlb的吸收光谱有二个强吸收峰640——660nm红光部分叶绿素特有410——470nm蓝紫光部分卟啉环化合物共有（2）荧光和磷光荧光现象：Chl

3、溶液在透射光下呈绿色，而反射光下呈红色的现象。强度大，寿命短（10-9秒）磷光：Chl溶液停止光照后，仍能在一定时间内放出暗红色的光。寿命长（10-2秒——10-3秒）1.2类胡萝卜素类胡萝卜素胡萝卜素橙黄色不溶于水叶黄素鲜黄色溶于有机溶剂分子式、结构式：胡萝卜素：C40H56有α、β、γ三种同分异构体叶黄素是胡萝卜素的衍生物，其两端的紫罗兰酮环第四位C上的H被OH取代，分子式为C40H56O2类胡萝卜素吸收光谱都在蓝紫光部分，所吸收的光能传递给叶绿素用于光合作用，保护叶绿素分子不被氧化或阳光破坏1.3类黄酮类根据

4、三碳桥的氧化程度可分为：花色素苷：呈现颜色。紫色锌化物、红色的碱盐、无色化合物黄酮防御伤害。存在于花器官和绿叶中。黄酮醇紫外光保护剂，吸收UV-B，避免细胞受到伤害。异黄酮功能多样。鱼藤酮杀虫，植物防御素抑制微生物。花色素苷分布广，溶解于细胞液中，与花、果、叶的颜色有关。颜色受多因素影响：B环上羟基和甲氧基数目羟基数多，吸收光向长波迁移，颜色偏蓝羟基被甲氧基替代，吸收光向短波迁移，颜色偏红芳香酸对主要骨架的酯化液泡中pH值酸红碱蓝营养状况低温、缺氮、缺磷促进化色素的形成和积累不同花色素的取代基和颜色花色素3’4’5

5、’颜色花葵素-H-OH-H橙红花青素-OH-OH-H紫红花翠素-OH-OH-OH蓝紫芍药素-OCH3-OH-H玫瑰红甲花翠素-OCH3-OH-OH紫二甲花翠素-OCH3-OH-OCH3紫红二.试剂与材料2.1实验试剂：石油醚（沸程60℃∽90℃）、丙酮、甲醇、氢氧化钾、石英砂、碳酸镁、氯化钠、醋酸铜。2.2仪器和器皿：分光光度计、台秤、剪刀、研钵、移液管、漏斗、大试管、层析缸2.3材料：新鲜菠菜叶片，不同颜色的花和果实。三.实验操作丙酮研磨提取叶绿素↓过滤、洗研钵及残渣↓↓2mL丙酮提取液余下的色素提取液用石油醚萃

6、取↓↓↓↓↓加入6NHCl纸层析荧光皂化反应光破坏（脱镁叶绿素）↓↓分离色素Cu取代↓扫描光谱花色素实验四.结果与分析对实验现象作好详细记录，并加以解释请对皂化反应现象做出合理解释，而不是单单用反应方程式来表示五.注意事项实验中注意安全，石油醚、丙酮等试剂要远离火源。研磨过程中丙酮要少量多次加入，以免研磨时四处飞溅。过滤时不要使用滤纸而使用棉花，棉花塞在漏斗基部要松紧适当。叶绿素要避光保存。六.思考题6.1叶绿素、荧光素酶以及绿色荧光蛋白都能产生荧光，它们的原理有什么不同？能量来源有何差异？6.2转GFP的植物在检

7、测绿色荧光时为何没有看到叶绿素的红色荧光?若选择荧光标记绿色植物细胞,在选择荧光物质时应首先考虑什么问题?6.3如何判断呈橙黄色的花和果实中含的是类胡萝卜素还是花色素？