叶绿体色素的提取分离及其理化性质的鉴定实验

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1、光合和呼吸代谢【模块实验目的】光合作用与呼吸作用是植物代谢的两大核心内容。前者是物质合成与能量储存的过程，属于同化作用，为包括人类在内的几乎所有生物的生存提供了物质来源和能量来源，对人类和整个生物界都具有非常重要的意义；后者是物质分解与能量释放过程，属于异化作用，为生命活动提供能量。光呼吸是在光下绿色细胞发生吸氧与放出二氧化碳的过程，虽然在气体交换方面它与光合作用正好处于相反方向，但无论从发生部位、对光的依赖及在生化上的联系来看，都同光合作用具有很密切的关系。本模块实验通过测定玉米种子萌发至两周内的呼吸速率。线粒体H+-ATP酶活性、光合速率、叶片中叶绿素含量及

2、乙醇酸氧化酶活性，了解研究植物的光合和呼吸代谢的基本方法。【流程图】玉米种子培养一周幼苗乙醇酸氧化酶活性测定呼吸速率测定光合速率测定线粒体H+-ATP酶活性测定叶绿体色素的提取和分离叶绿体色素理化性质叶绿素a和b含量测定4-1叶绿体色素的提取和分离[实验目的]了解和掌握叶绿体色素提取、分离的原理和方法。[实验原理]叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类。他们与类囊体膜相结合成为色素蛋白复合体。这两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。提取液可用色谱分析的原理加以分离。因吸附剂对不同物质的吸附

3、力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可分开各种色素。[器材与试剂]1.实验仪器与用具研钵、漏斗、剪刀、滴管、圆形滤纸（直径11cm）、层析缸2.实验试剂丙酮、甲醇、石英砂、碳酸钙、无水硫酸钠、四氯化碳、乙醚3.实验材料玉米幼苗叶片[实验步骤]1.叶绿体色素的提取：取新鲜叶片4g，洗净，擦干，去掉中脉，剪碎，放入研钵中，研钵中加2~3ml95%乙醇，研磨至匀浆，再加10~15ml95%乙醇，提取3~5min，过滤，残渣用5ml95%乙醇冲洗，合并滤液，定容至25ml。2.将展

4、层用的圆形滤纸剪成2cm×20cm的纸条，其中一端剪去两侧，中间留一窄条，长约1.5cm，宽约0.54cm。3.用滴管吸取乙醇叶绿体色素提取液，点于窄条上方，一次点的溶液不可过多，风干后，重复操作。4.在层析缸中加入四氯化碳3~5ml以及少许无水硫酸钠，将滤纸条插入层析缸内，使其浸入溶剂中，注意色素点样点要稍高于液面，待展层液达滤纸上沿1.5~2cm时，停止展层，用铅笔标出溶液前沿，风干。[实验作业]用铅笔标出滤纸上分离的各种色素位置，写出名称，分析原因。4-2叶绿体色素理化性质的鉴定[实验目的]了解和掌握叶绿体色素提取、分离的原理和方法。[实验原理]叶绿素是二

5、羧酸酯，与强碱反应形成绿色的可溶性叶绿素盐，可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开；在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg2+可依次被H+和Cu2+取代，形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素；叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。[器材与试剂]1.实验仪器与用具分光光度计、电子天平、量筒、剪刀、漏斗、滤纸、移液管（1ml）、试管、试管架、洗耳球、酒精灯2.实验试剂丙酮、80%丙酮、乙酸铜、5%盐酸、碳酸钙、石英砂等3.实验材料水稻叶片、玉米幼苗叶片[实验步骤]1.叶绿体色素的提取取新鲜叶片0.3g，洗净，擦干，去掉中脉，剪碎，放入研钵中。加入少量石英

6、砂及碳酸钙粉末，2~3ml95%乙醇，研磨至匀浆，再加2~3ml95%乙醇，过滤，即得色素提取液。提取的叶绿体色素溶液适当稀释后，可进行后面实验。2.荧光现象的观察取一支试管，加入未稀释的色素提取液，在直射光下，分别观察透射光与反射光溶液的颜色。3.氢和铜对叶绿素分子中镁的取代作用取两支试管。分别加入色素提取液2ml，第一支试管作为对照；第二支试管另加1滴稀盐酸，摇匀，观察溶液颜色变化。第二支试管内的溶液变褐色后，再加入少量乙酸铜粉末，微微加热，与对照试管比较，观察溶液颜色变化。4.皂化作用取叶绿体色素提取液2ml于大试管中，加入4ml乙醚，摇匀，再沿试管壁慢慢

7、加入3~6ml蒸馏水，轻轻混匀，静置片刻，溶液即分为两层，色素已全部转入上层乙醚中。用吸管吸取上层绿色层溶液，放入另一试管中，再用蒸馏水冲洗1或2次。在色素乙醚溶液中加入30%KOH-甲醇溶液，充分摇匀，再加入蒸馏水约3ml，摇匀静置。可以看到溶液逐渐分为两层，下层是水溶液，其中溶有皂化的叶绿素a和b；上层是乙醚溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。将上下层分别放入两试管中，可供观察吸收光谱用。5.叶绿体色素吸收光谱曲线将叶绿体色素提取液注入1cm比色杯中，另取95%乙醇作空白，用分光光度计测定400~700的光密度值（间隔10nm）读取。[实验作业]根据测定结

8、果，以波长为横坐标，以光