引物合成常规问题

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1、Q1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种,无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。(1)  去保护：加入Deblocking脱去碱基上5'-OH的保护基团DMT，获得游离的5'-OH； (2)  耦合：同时加入活化剂和新的碱基，新的碱基5'-OH仍然被DMT保护，3'端被活化与溶液中游离的5'-OH发生耦合反应；(3)  封闭：耦合反应中极少数5'-OH没有参加反应，用封闭试剂终止其后继续发生反应；(4)  氧化：加入氧化剂使其由核苷亚磷酸酯

2、形成更稳定的核苷磷酸酯。Q2.引物合成后如何处理？切割与脱保护基：将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。常用新鲜的浓氨水来裂解CPG与初始核苷之间的酯键。断裂下来的寡核苷酸带有自由的3’羟基。纯化：根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化的方法。常用的纯化方法有：C18、OPC、PAGE和HPLC。定量：根据寡核苷酸在260nm处的紫外吸收来定量。储存：分装抽干。Q3.需要什么级别的引物？根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。应用    引物长度要求    纯度级别要求一般PCR扩增    <60base    HEPD    >60base 

3、   PAGE诊断PCR扩增    <40base    HEPD,PAGEDNA测序    20base左右    HEPD亚克隆，点突变等    根据实验要求定    HEPD,PAGE，HPLC基因构建（全基因合成）    根据实验要求定    HEPDPAGE反义核酸    根据实验要求定    HEPDPAGE修饰引物    根据实验要求定    PAGE,HPLCQ4.引物的质量是不是跟序列有关？四种碱基的性质和各自保护基的性质都有差别。所以合成难度是不一样的。难度最大的当属GC重复多的和序列中还有多个连续的G的引物。尤其对于后者，国内公

4、司一般都做不了20个G以上的引物。实验证明，如果引物中有超过三个连续G的结构，传统方法得到的产物质量就会开始下降。而且目前通用的脱盐、OPC和PAGE方法都无效。鼎国昌盛生物公司拥有的HEPD专利技术能够克服高GC或者高G含量引物的合成和纯化障碍，对普通引物、高GC引物和无论长短的oligod（G）都能得到同样的非常好的结果。Q5.需要合成多少OD数？根据实验目的确定。一般PCR扩增，2OD引物，可以做500-1000次50ul标准PCR反应。如果是做基因拼接或退火后做连接，1OD就足够了。Q6.如何计算引物的浓度？引物保存在高浓度的状况下比较稳定。

5、一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成100pmol/ul，称为保存浓度，而引物的工作浓度一般配制成10-50pmol/ul。加水的体积（微升）可直接参照合成报告单上推荐的体积，也可按下列方式计算：V(微升)=OD数x33x10000/引物的分子量引物的分子量可以从合成报告单上获得。注意：1OD260=33ug/ml。Q7.如何计算引物的Tm值？引物设计软件都可以给出Tm，与引物长度、碱基组成及所使用缓冲夜的离子强度有关。长度为25base以下的引物，Tm计算公式为：Tm=4℃(G+C)+2℃(A+T)对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm=81

6、.5+16.6xLog10[Na+]+0.41(GC%)–600/size＊＊公式中，Size=引物长度。Q8.引物（含修饰）的分子量是如何确定的？非修饰的引物的分子量（MW）在随引物提供的报告单上可以找到。如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为324.5，引物的分子量=碱基数x碱基的平均分子量，或按下列公式计算MW=(NA*WA)+(NC*WC)+(NG*WG)+(NT*WT)+(Nmod*Wmod)＋(Nx*Wx)+(NI*WI)+16*Ns–62.NA,NG,NC,NT,NI分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量，WA,WG,W

7、C,WT,WI分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod分别为修饰基团的数目和分子量。对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数，例如G+A混合的分子量为（313.21+329.21）/2=321.21。Ns为硫代数目，硫代每个位置增加分子量16。常规碱基分子量Base    MolecularWeightA    313.21C    289.18G    329.21T    304.19I    314.2U    290.17常规修饰基团分子量5’-Biotin    405.45    3’-TAMARA   

8、 623.605’-(6FAM)    537.46    3’-Dabsyl    498.495’-HE