引物合成详解

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1、引物合成的详解引物合成的详解1.引物是如何合成的?目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种,主要都是由ABI/PE公司生产,无论采用什么机器合成,合成的原理都相同,主要差别在于合成产率的高低,试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。亚磷酰胺三酯法合成DNA片段,具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的,合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的,相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应,脱去其5′-羟基的保护基团

2、DMT,获得游离的5′-羟基。第二步,合成DNA的原料,亚磷酰胺保护核苷酸单体,与活化剂四氮唑混合,得到核苷亚磷酸活化中间体,它的3′端被活化,5′-羟基仍然被DMT保护,与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应。第三步,带帽(capping)反应,缩合反应中可能有极少数5′-羟基没有参加反应(少于2%),用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应,这种短片段可以在纯化时分离掉。第四步,在氧化剂碘的作用下,亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。经过以上四个步骤,一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5′-羟基上的保护基团DMT,重复以上步骤,直到所有要求合成的碱

3、基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。通过氨水高温处理,连接在CPG上的引物被切下来,通过OPC,PAGE等手段纯化引物,成品引物用C18浓缩,脱盐,沉淀。沉淀后的引物用水悬浮,测定OD260定量,根据定单要求分装。2.引物纯化方式有哪些,如何选择?◆ C18柱脱盐:有人称其为简易反相柱,它对DNA有特异性的吸附,可以被有机溶解洗脱,但不会被水洗脱,所以能有效地去除盐分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。实际上,它是一种脱盐的作用。这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。◆ OPC纯化:OPC纯化是根据

4、DNA保护基(DMTr基)和Cartridge柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段。OPC法纯化的DNA纯度大于95%。适用于40mer以下引物的纯化。◆ PAGE纯:PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,对DNA片段进行分离,然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法,纯化后的DNA纯度大于95%,对长链OligoDNA(大于50mer)的纯化特别有效。◆ HPLC纯化:HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理,对DNA片段进行纯化。纯度可以大于99%。主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的弱点是成本较高,批量生产效率不高。

5、3.引物的OD数如何定量?答:引物合成引物OD数是这样测定的:用紫外分光光度计,波长260nm,石英比色杯,光程为1厘米,测定溶液的光密度。测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后,用1ml水稀释测OD值。需要根据稀释倍数换算出母液的OD值。4.需要什么级别的引物?答:引物常用的纯化方式C18脱盐,OPC纯化,PAGE纯化,HPLC纯化。根据实验需要,确定订购引物的纯度级别。应用引物长度要求纯度级别要求一般PCR扩增<45baseOPC一般PCR扩增>45basePAGE诊断PCR扩增<40baseOPC,PAGEDNA测序20b

6、ase左右OPC亚克隆,点突变等根据实验要求定OPC,PAGE,HPLC基因构建(全基因合成)根据实验要求定PAGE反义核酸根据实验要求定PAGE修饰引物根据实验要求定PAGE,HPLC5.最长可以合成多长的引物?答:引物越长,出现问题的概率就越大。有的公司合成过120base的引物,产率很低。除非需要,建议合成片段长度不要超过80mer,按照目前的引物合成效率,80mer的粗产品,全长(还不一定正确)引物的百分比不会超过40%,后续处理还有丢失很多,最后的产量很低。6.需要合成多少OD数?答:根据实验目的确定。一般PCR扩增,2OD引物,可以做200-500次50ul标准PC

7、R反应。如果是做基因拼接或退火后做连接,1OD就足够了。但是有些研究人员,就做几次PCR,但是却要5-10OD。做全基因构建的引物都比较长,但是我们有些研究人员也要求高OD数。片段越长,最后全长得率就越低,出错的几率就越大。超出需要之外的OD数要求,其实也是对社会资源的一种浪费,同时也从一个侧面反映了部分研究人员特别是新手的自信心不足,总觉得需要重复多次才能成功。7.如何检测引物的纯度?答:实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取0.2-0.5O

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